一种纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法

本发明涉及菌种选育，尤其涉及一种纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法。

背景技术：

1、纳豆激酶(nattokinase，简称nk)是一种枯草杆菌蛋白激酶,是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶具有溶血栓、抗动脉粥样硬化、降血压、降血脂等作用，而且安全性高，药效持久，是一种具有广阔应用前景的天然药物。

2、目前，纳豆激酶的生产主要是微生物发酵法。纳豆芽孢杆菌(bacillus subtilisnatto，bsn)是一种革兰氏阳性菌，被应用于纳豆激酶和维生素k2等保健品的生产，相关研究主要集中在纳豆芽孢杆菌的菌株选育、发酵工艺优化、菌株的代谢工程改造、营养缺陷型菌株的构建等。发酵所用的菌种对所生产的纳豆激酶的活力具有关键的影响。因此，选育具有高纳豆激酶活性的纳豆枯草芽孢杆菌，对提高纳豆激酶的药用价值具有非常重要的意义。

3、低能氮离子注入是一种新型的诱变技术，因其对细胞钝化作用小且正突变率较高，最早应用于水稻等农作物的育种改良中。近年来，低能氮离子注入技术成功应用于维生素c、柠檬酸、酶制剂等的高产菌株选育中，使其在微生物菌株选育和食品的诱变效应中也发挥着重要作用。目前，还未见将低能氮离子注入应用于高纳豆激酶活性的纳豆芽孢杆菌选育的报道。

技术实现思路

1、基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法。

2、本发明提出的一种纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，包括以下步骤：

3、s1、选择出发菌株；

4、s2、将所述出发菌株进行培养得到种子液，将所述种子液涂布在培养皿上，进行低能氮离子注入诱变，然后以无菌水洗脱，涂布于酪蛋白培养基上进行培养；

5、s3、以透明圈直径与菌落直径的比值h为指标进行初筛，选择h值高于出发菌株10％以上的菌落接种于液体发酵培养基中进行培养，将得到的发酵液离心后取上清液测定纳豆激酶活力，进行复筛，选择纳豆激酶活力高于出发菌株10％以上的诱变菌株作为正突变株；

6、s4、将复筛得到的正突变株连续传代5代以上，选择纳豆激酶活性稳定的菌株作为选育得到的高纳豆激酶活性纳豆枯草芽孢杆菌菌株。

7、优选地，s1中，从纳豆中筛选得到高纳豆激酶活性的纳豆枯草芽孢杆菌作为出发菌株。

8、优选地，s1中，将纳豆置于装有生理盐水的培养瓶中，先于37℃下振荡培养一段时间，然后于75～90℃下水浴10～20min，得到菌液；将所述菌液稀释后涂布于酪蛋白培养基上进行培养，以透明圈直径与菌落直径的比值h为指标，选择h值较大的菌落，接种于种子培养基中，于37℃下振荡培养一段时间，将得到的发酵液离心后取上清液测定纳豆激酶活力，选择纳豆激酶活力最高的菌株作为出发菌株。

9、优选地，s1中，将纳豆置于装有生理盐水的培养瓶中，先于37℃下振荡培养5～8h，振荡培养的转速为100～200r/min。

10、优选地，s1中，选择h值较大的菌落，接种于种子培养基中，于37℃下振荡培养40～60h，振荡培养的转速为150～200r/min。

11、优选地，s2中，低能氮离子注入的能量为4～20kev，剂量为20×2.6×1013～100×2.6×1013n+/cm2。

12、优选地，s2中，低能氮离子注入的能量为16kev，剂量为80×2.6×1013n+/cm2。

13、优选地，s2中，涂布于酪蛋白培养基上于37℃下培养24～36h。

14、优选地，s3中，菌落接种于液体发酵培养基中进行培养的温度为37℃，培养时间为30～40h。

15、优选地，所述酪蛋白培养基包括下述原料：琼脂粉20g、干酪素5g、葡萄糖1g、酵母膏1g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾0.5g、无水硫酸镁0.1g、去离子水1.0l，其ph为7.0～7.2；

16、优选地，所述液体发酵培养基包括下述原料：胰蛋白胨20g、磷酸氢二钠5g、磷酸二氢钠1.5g、葡萄糖20g、氯化钙0.2g、硫酸镁0.3g、去离子水1.0l。

17、本发明的有益效果如下：

18、本发明先通过低能氮离子注入对纳豆枯草芽孢杆菌进行诱变，再以菌株的透明圈直径与菌落直径的比值h作为指标进行初筛，选取h值较大的菌株进行发酵，以纳豆激酶活力作为指标进行复筛，选取纳豆激酶活力高、且传代稳定的正突变株，从而选育得到的高纳豆激酶活性纳豆枯草芽孢杆菌菌株。本发明的方法能够应用于具有高纳豆激酶活性的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育中，具有较高的正突变率，诱变效果好，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，s1中，从纳豆中筛选得到高纳豆激酶活性的纳豆枯草芽孢杆菌作为出发菌株。

3.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，将纳豆置于装有生理盐水的培养瓶中，先于37℃下振荡培养一段时间，然后于75～90℃下水浴10～20min，得到菌液；将所述菌液稀释后涂布于酪蛋白培养基上进行培养，以透明圈直径与菌落直径的比值h为指标，选择h值较大的菌落，接种于种子培养基中，于37℃下振荡培养一段时间，将得到的发酵液离心后取上清液测定纳豆激酶活力，选择纳豆激酶活力最高的菌株作为出发菌株。

4.根据权利要求3所述的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，s1中，将纳豆置于装有生理盐水的培养瓶中，先于37℃下振荡培养5～8h，振荡培养的转速为100～200r/min。

5.根据权利要求3所述的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，s1中，选择h值较大的菌落，接种于种子培养基中，于37℃下振荡培养40～60h，振荡培养的转速为150～200r/min。

6.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，s2中，低能氮离子注入的能量为4～20kev，剂量为20×2.6×1013～100×2.6×1013n+/cm2。

7.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，s2中，低能氮离子注入的能量为16kev，剂量为80×2.6×1013n+/cm2。

8.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，s2中，涂布于酪蛋白培养基上于37℃下培养24～36h。

9.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，s3中，菌落接种于液体发酵培养基中进行培养的温度为37℃，培养时间为30～40h。

技术总结
本发明公开了一种纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育方法，先通过低能氮离子注入对纳豆枯草芽孢杆菌进行诱变，再以菌株的透明圈直径与菌落直径的比值H作为指标进行初筛，选取H值较大的菌株进行发酵，以纳豆激酶活力作为指标进行复筛，选取纳豆激酶活力高、且传代稳定的正突变株，从而选育得到的高纳豆激酶活性纳豆枯草芽孢杆菌菌株。本发明的方法能够应用于具有高纳豆激酶活性的纳豆枯草芽孢杆菌的诱变选育中，具有较高的正突变率，诱变效果好，具有良好的应用前景。

技术研发人员：孔文辉,陈家怡,方雪,叶寒,阳俊毅,陈晴
受保护的技术使用者：合肥师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15