一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用的制作方法

本发明涉及生物制造领域，尤其涉及一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用。

背景技术：

1、氨基葡萄糖（glucosamine，glcn）简称氨糖，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后形成的一种重要的功能性单糖产物，是合成糖胺聚糖如透明质酸、硫酸软骨素和硫酸角藻聚糖的重要前体物质，广泛存在于所有生物体中，包括细菌、酵母、丝状真菌及动植物。作为生物体内多糖的重要单体之一，氨基葡萄糖可有效治疗关节炎，参与肝肾解毒和护肝，还能抗衰老、刺激婴儿肠道内双歧杆菌的生长、调节内分泌。氨基葡萄糖还是组成黏膜分泌物、结缔组织、皮肤、肌腱、韧带和软骨等必不可少的成分。

2、氨基葡萄糖常用的生产方法包括三种，即几丁质水解法、生物转化法与微生物发酵法。几丁质水解法是利用强酸将虾蟹外壳中提取的几丁质进行水解来获得氨基葡萄糖，会产量大量的环境污染物，而且其原料会受到地域和季节的限制；生物转化法生产氨基葡萄糖，为了维持酶制剂的活性和稳定性，该方法生产成本过高，因此很难实现工业生产；微生物发酵法作为最有潜力的生产方式，基本克服了以上两种生产方式的缺点，具有发酵时间短、生产效率高、环境污染小、易于规模化生产的优点。随着生物技术的发展，氨基葡萄糖的生产方式主要以微生物发酵法为主。但是目前发酵法生产氨基葡萄糖仍然存在菌种不稳定、发酵水平波动较大等问题，时常出现发酵生产异常，使氨基葡萄糖的生产成本居高不下，因此，选育优良稳定的氨基葡萄糖生产菌株对工业生产具有极其重要的意义。

技术实现思路

1、本发明提出了一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用。发酵过程菌株性能稳定，发酵液中具有较高的产物浓度。

2、本发明的目的之一，是提供一株大肠埃希氏菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（escherichia coli）ecozh1009，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为cgmcc no.26218。

3、本发明的目的之二，是提供一种大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌（escherichia coli）ecozh1009生产氨基葡萄糖。使用该菌株进行发酵生产氨基葡萄糖，发酵过程菌株性能稳定，发酵液中具有较高的产物浓度。

4、所述生产氨基葡萄糖的方法包括：

5、（1）菌种活化：将冷冻保藏的大肠埃希氏菌（escherichia coli）ecozh1009室温下解冻，在超净工作台上取解冻后的菌液接种于lb液体培养基中进行活化培养，在200 rpm的恒温摇床中37℃培养12h；

6、（2）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基中种子培养；

7、（3）发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养得到含有氨基葡萄糖的发酵液。

8、进一步地，lb液体培养基包含胰蛋白胨10 g/l、酵母提取物5 g/l、氯化钠5 g/l，ph调至7.0。

9、进一步地，种子培养基包含葡萄糖30~50 g/l、磷酸二氢钾1~5 g/l、磷酸氢二钾5~20 g/l、硫酸铵1~3 g/l、硫酸镁1~5 g/l、多肽粉1~10 g/l、蛋白胨1~10 g/l、酵母浸粉1~10g/l。

10、进一步地，发酵培养基包含葡萄糖30~50 g/l、磷酸5~20 g/l、氯化钾1~10 g/l、硫酸铵5~10 g/l、硫酸镁0.1~2 g/l、多肽粉10~30 g/l、酵母浸粉5~10 g/l。

11、进一步地，种子培养控制条件：温度37℃、罐压0.05mpa、ph7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，培养时间10~15h。

12、进一步地，发酵培养条件为：温度37℃、罐压0.05~0.10mpa、ph7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/l。

13、本发明的有益效果是：

14、本发明通过大量诱变筛选试验，获得一株大肠埃希氏菌ecozh1009，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26218，经过检测鉴定，该菌株具有独特的生理和生化特性，可在科研、工业生产等领域进行应用。本发明中的大肠埃希氏菌ecozh1009，在发酵过程中菌株能保持良好的性能，经过稳定性试验测试该菌株具有良好的稳定性，发酵结束后产物的浓度有了显著提高，该菌株培养基成分简单、培养条件粗放，易于工业化放大生产，具有较好的实际应用价值。

技术特征：

1.一株大肠埃希氏菌，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（escherichiacoli）ecozh1009，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为cgmcc no.26218。

2.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，采用大肠埃希氏菌（escherichia coli）ecozh1009生产氨基葡萄糖。

3.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，生产方法包括：

4.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，lb液体培养基包含胰蛋白胨10 g/l、酵母提取物5 g/l、氯化钠5 g/l，ph调至7.0。

5.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，种子培养基包含葡萄糖30~50 g/l、磷酸二氢钾1~5 g/l、磷酸氢二钾5~20 g/l、硫酸铵1~3 g/l、硫酸镁1~5 g/l、多肽粉1~10 g/l、蛋白胨1~10 g/l、酵母浸粉1~10 g/l。

6.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，发酵培养基包含葡萄糖30~50 g/l、磷酸5~20 g/l、氯化钾1~10 g/l、硫酸铵5~10 g/l、硫酸镁0.1~2 g/l、多肽粉10~30 g/l、酵母浸粉5~10 g/l。

7.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，种子培养控制条件：温度37℃、罐压0.05mpa、ph7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，培养时间10~15h。

8.根据权利要求3-7任一项所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，发酵培养条件为：温度37℃、罐压0.05~0.10mpa、ph7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/l。

技术总结
本发明公开了一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用，大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1009，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.26218。本发明使用大肠埃希氏菌ecozh1009发酵生产氨基葡萄糖，在发酵过程中菌株能保持良好的性能，经过稳定性试验测试该菌株具有良好的稳定性，发酵结束后产物的浓度有了显著提高，该菌株培养基成分简单、培养条件粗放，易于工业化放大生产，具有较好的实际应用价值。

技术研发人员：张天惕,周旭波,唐海静,倪军,马淑芳,高建国
受保护的技术使用者：欧铭庄生物科技（天津）有限公司滨海新区分公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15