一种多重ddPCR检测新型冠状病毒的引物组及其应用的制作方法

本发明属于病毒检测，具体涉及一种多重ddpcr检测新型冠状病毒的引物组及其应用。

背景技术：

1、由严重急性呼吸综合征冠状病毒2号(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，sars-cov-2，简称新冠病毒)引发的新冠感染在全球范围内波及蔓延。sars-cov-2是迄今为止被发现的第7种可以引发机体感染的β属冠状病毒，有包膜，直径约60～140nm，基因组核酸类型为单股正链rna，大小约为30kb。其中，非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(open reading frame，orf)orf1a和orf1b基因，编码16个非结构蛋白，结构蛋白主要通过核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)、包膜蛋白(envelope protein，e)、膜蛋白(membrane protein，m)和刺突蛋白(spike protein，s)维持病毒的转录和复制，促进病毒的遗传物质侵入宿主细胞干扰正常生命等活动。sars-cov-2可以跨越物种屏障感染人类和动物(果子狸、单峰骆驼、穿山甲、蝙蝠等)。研究表明，sars-cov-2在全基因组水平上与蝙蝠冠状病毒有96％的相同性，被认为是携带新冠病毒的天然宿主。sars-cov-2具有灵活的基因重组和快速适应突变能力，已不断进化演变出新的冠状变异株(包括alpha、beta、gamma、delta和omicron)，因此在sars-cov-2的核酸检测中，对病原毒株类型的鉴定具有更高要求。

2、从去年到今年本土病例sars-cov-2基因组有效序列均为omicron变异株，该变异株携带大量突变，仅在s蛋白末端的受体结合域(receptor binding domain，rbd)上就存在15个突变位点，rbd与人体细胞表面的血管紧张素转换酶2(angiotensin convertingenzyme 2，ace2)受体结合增加ace2-rbd亲和力，病毒能够逃避免疫保护屏障，使omicron变异株更具传播性和感染能力，omicron变异株感染人数多但较早期致病力明显下降，感染症状已逐渐演化为一种常见的呼吸道传染病。目前，市面上sars-cov-2核酸检测试剂引物和探针靶标大多针对于orf1ab基因、n基因和e基因设计，不能满足omicron变异株检测需求。根据sars-cov-2各变异株之间s基因的序列差异，开发可以快速高效鉴定出omicron突变株的检测方法，在全球范围内对这一新变异株的监测至关重要。

3、微滴式数字pcr技术在荧光定量pcr技术(quantitative real-time pcr，qpcr)的基础上将核酸的定量检测由相对定量提高到绝对定量，是分子生物学检测领域最为重大创新之一。在ddpcr中，通过微滴化处理将目的模板和反应混合物稀释分散成2万多个油包水的细小微滴，每个微滴只含有1个或0个待检核酸分子，微反应体系扩增后，对每个微滴的荧光信号进行采集并分析，使用泊松分布定律进行计算，无需绘制标准曲线就可推算出目标分子的原始拷贝数，实现复杂背景下对微量核酸样本的绝对定量检测。截止目前，有研究者建立的三重ddpcr方法用于检测生物与环境样本中sars-cov-2，与rt-qpcr相比其在检测低病毒载量的样本有更高的灵敏度和准确性(p<0.05)，有效降低了假阴性检出率；还有研究者开发出一种rt-ddpcr检测方法，用于同时检测sars-cov-2和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，sads-cov)，测试结果显示灵敏度分别比rt-pcr高4倍和10倍，该测试还表现出良好的特异性、可重复性和再现性等优点。

4、综上所述，设计专门针对于omicron变异株s基因的引物探针，采用定量分析检测方法—ddpcr技术，建立sars-cov-2omicron变异株四重微滴式数字pcr检测方法，实现对sars-cov-2orf1ab基因、n基因和e基因检测的同时，还能对omicron变异株s基因进行鉴别的双重功能，在病毒将检测技术领域具有至关重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述不足，本发明提供一种多重ddpcr检测新型冠状病毒的引物组及其应用，采用本发明所设计的引物组以及本发明所建立的检测方法同时对sars-cov-2orf1ab基因、n基因、e基因检测和omicron变异株进行检测，特异性强，检测结果复合率高并且灵敏度高，本发明建立多重ddpcr检测新型冠状病毒的引物组可用于临床样本中对微量新冠病毒准确快速检出。

2、本发明采用以下技术方案：

3、一种多重ddpcr检测新型冠状病毒的引物组，引物组包括引物和探针，引物和探针的核苷酸序列如下：

4、orf1ab-f：5’-tgtgctaatgaccctgt-3’(seq id no：1)；

5、orf1ab-r：5’-gtttaaaaacgattgtgcatcag-3’(seq id no：2)；

6、orf1ab-p：5’-aactccgcgaacccatgctt-3’(seq id no：3)；

7、n-f：5’-gtcaagcctcttctcgtt-3’(seq id no：4)；

8、n-r：5’-attgccagccattctagcag-3’(seq id no：5)；

9、n-p：5’-cctcatcacgtagtcgcaacagt-3’(seq id no：6)；

10、e-f：5’-tttcttgctttcgtggt-3’(seq id no：7)；

11、e-r：5’-tttaacacgagagtaaacgta-3’(seq id no：8)；

12、e-p：5’-cttcgattgtgtgcgtactgct-3’(seq id no：9)；

13、s-f：5’-gttgctgattattctgtccta-3’(seq id no：10)；

14、s-r：5’-agacattagtaaagcagagat-3’(seq id no：11)；

15、s-p：5’-acacttaaaagcgaaaaatggt-3’(seq id no：12)。

16、进一步地，上述orf1ab-p的5’端标记有fam，3’端标记有bhq1；所述n-p的5’端标记有hex，3’端标记有bhq1；所述e-p的5’端标记有rox，3’端标记有bhq2；所述s-p的5’端标记有cy5，3’端标记有mgb；所述标记后的探针分别为：

17、orf1ab-p：5’-fam-aactccgcgaacccatgctt-bhq1-3’；

18、n-p：5’-hex-cctcatcacgtagtcgcaacagt-bhq1-3’；

19、e-p：5’-rox-cttcgattgtgtgcgtactgct-bhq2-3’；

20、s-p：5’-cy5-acacttaaaagcgaaaaatggt-mgb-3’。

21、上述引物组在制备用于检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。

22、一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括上述的引物组。

23、进一步地，上述用于检测新型冠状病毒的试剂盒还包括5x one step rt-pcrprobe super mix(cy5.5)，enzyme mix，ecori酶和dd h2o。

24、采用上述技术方案，本发明的有益效果为：

25、本发明根据新冠病毒原型株及变异株基因组参考序列，设计出特异性引物探针，通过优化多重ddpcr反应体系和扩增条件，最终建立了sars-cov-2orf1ab基因、n基因、e基因以及omicron变异株s基因四重微滴数式数字pcr定量检测方法，该方法绝对定量检测下限分别为分别为orf1ab基因0.59copies/μl；n基因0.68copies/μl；e基因1.44copies/μl；s基因1.03copies/μl，将本发明所设计的引物探针组合结合多重ddpcr方法用于临床能够对微量新冠病毒准确快速检出，有利于维护公共卫生安全。

26、本发明将omicron变异株与alpha株、beta株、gamma株、delta株进行序列比对分析，发现omicron变异株s基因的n末端结构域(n-terminal domain，ntd)上存在连续的突变位点，基于该段突变位点，固定taqman探针，从而筛选omicron变异株s基因的特异性引物，而omicron变异株新的进化分支xbb毒株发生了新的突变，与taqman探针的结合有一定影响，但ba.1、ba.4和ba.5毒株含有与本实验taqman探针相同的特征序列，本研究设计的多重ddpcr反应体系还可以对ba.1、ba.4和ba.5毒株进行检测。