一种基于Cre重组酶的人腺病毒HAd5C改造方法与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种基于cre重组酶的人腺病毒had5c改造方法。

背景技术：

1、腺病毒是从呼吸道感染的婴儿扁桃体腺中分离培养得到，可分为a-g七个种，超过100个血清型。人腺病毒(human adenovirus，hadv)属于腺病毒科(adenoviridae)哺乳动物腺病毒属(mastadenovirus)。腺病毒具有外源基因较大的装载容量，因此腺病毒可作为基因表达载体，被广泛应用于基因治疗和病毒溶瘤等方面。腺病毒也是疫苗开发中常采用的载体，以5亚型腺病毒载体居多。

2、腺病毒属线性双链dna病毒，病毒颗粒直径65-90nm，为无包膜二十面体结构，由240个六邻体组成，每个顶点处有12个五邻体蛋白，并有从每个五邻体突出的12个纤维蛋白三聚体。人腺病毒基因组全长约36kb，包括早期转录基因(e1a、e1b、e2、e3、e4)和晚期转录基因(l1-l5)。e1a是基因组中最早被转录的基因，其编码产物与宿主细胞prb蛋白结合，导致e2f转录因子与prb蛋白分离，进而激活e2f介导其他早期转录基因(e1b、e2、e3、e4)的转录，启动病毒dna的复制。随后，e1b编码的e1b-55k蛋白与细胞的p53蛋白结合并使之失活，同时e1b-19k蛋白作为细胞凋亡因子阻止细胞凋亡。e2则编码病毒基因组复制所必需的3种蛋白：前体末端蛋白(ptp)、聚合酶(pol)和单链dna结合蛋白(dbp)。e3基因编码可破坏宿主免疫反应的蛋白(10.4k、14.5k、14.7k和19k)，其中19k糖蛋白(gp19)下调mhcⅰ介导的抗原呈递给细胞毒性t淋巴细胞，从而阻止细胞毒性t淋巴细胞对病毒的杀伤作用；在病毒复制晚期，e3基因编码的蛋白可促进病毒粒子的释放和加快被感染细胞的死亡。e4的基因产物主要参与dna的复制、转录、宿主细胞蛋白质合成的终止和细胞周期的调节。晚期基因的转录起始于主要晚期启动子(mlp)，转录产物参与腺病毒基因组的调控，并编码成熟病毒颗粒装配所必需的衣壳结构蛋白。

3、腺病毒能在人体细胞中高效复制，被感染宿主细胞48h内能产生约107拷贝的病毒dna，较高的复制效率使其成为基因治疗载体的主要选择。腺病毒感染细胞主要分为3个步骤：1)腺病毒的纤维蛋白与宿主细胞膜上的腺病毒-柯萨奇受体(car)结合；2)病毒与整合素受体结合，经过内吞作用进入细胞，脱去衣壳，病毒dna通过核孔进入宿主细胞核；3)基因转录及病毒dna复制。腺病毒的dna复制主要需要5种蛋白质：包括由病毒自身编码产生的3种蛋白ptp、pol和dbp，以及来自宿主细胞的2种细胞转录因子nfi和oct-1。ptp、pol和dbp在一起可以启动dna复制，但复制效率低，而且链的延伸有限。而细胞转录因子nfi和oct-1的加入使得病毒dna的复制效率增强约200倍。hadv的dna复制起始发生于模板链的第4个碱基，形成三核苷酸中间体ptp-cat，然后ptp-cat中间体回跳3个碱基与模板链的残基1-3配对，在三核苷酸跳跃期间或之后，pol与ptp解离，延伸继续。

4、专利cn202010055543.9公开了一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒，其以野生型人3型腺病毒衣壳蛋白六邻体基因为保护性抗原基因，以e1、e3区基因缺失的人5型复制缺陷型腺病毒为载体，以整合e1区基因的ad293细胞为包装细胞系，制备得到的疫苗免疫小鼠后，可以诱导机体产生更高的体液免疫。专利cn202110193614.6则公开了一种人工改造的重组腺病毒载体，其基于黑猩猩型腺病毒adc68基因组序列，完全删除其e1序列，改造其e3序列和e4序列，所述改造包括：(1)改造其e3序列，保留orf9和orf1；(2)改造其e4序列，以c亚型人腺病毒基因组e4序列中orf6和/或orf6/7替换其e4序列中orf6和/或orf6/7；其所述的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且外源基因装载量高。

5、人腺病毒had5c是目前临床研究中最常用的溶瘤病毒载体，而要实现其溶瘤病毒的安全性及特异性则需要对had5c基因骨架进行改造，如fiber，hexon，penton等。目前常用的腺病毒骨架改造的方法有galk正负筛选，kana/sacb正负筛选等，其阴性筛选普遍存在假阴性(阴性筛选压力下筛选基因galk或sacb基因发生突变)比例较高且阴性筛选效率较低耗时较长的缺点，基于此，开发一种避免进行阴性筛选的构建策略尤为关键。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明提供了一种基于cre重组酶的人腺病毒had5c改造方法。本发明利用腺病毒admax系统中的载体pbhglox(delta)e13cre，该载体敲除了腺病毒复制关键基因e1和e3，其余骨架基因完整，因此可以用于had5c骨架基因的改造，通过将阳性筛选的抗性基因构建至该载体上，避免了阴性筛选效率低耗时长的缺点，筛选得到阳性载体后，进一步将抗性基因敲除，不影响外源基因的插入与表达。

2、本发明中，“δ”表示缺失，如“δe3”表示e3基因缺失。

3、为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

4、一方面，本发明提供了一种改造人腺病毒had5c的方法，所述的方法包括以下步骤：

5、(1)对于敲除腺病毒复制关键基因的admax系统腺病毒骨架载体，构建含抗性筛选标记1的表达框，表达框包含目的基因，同时在抗性筛选标记1两端设置重组酶切位点，得到抗性标记载体1；

6、(2)对抗性标记载体1进行抗性筛选，筛选后的载体利用重组酶删除抗性筛选标记；

7、所述的步骤(1)中所述的腺病毒复制关键基因为e3，目的基因的插入位点在δe3处。

8、优选地，所述的步骤(1)中的admax系统腺病毒骨架载体为pbhglox(delta)e13cre载体。

9、优选地，步骤(1)中所述的抗性为非氨苄抗性，进一步优选为kana抗性。本发明中，kana抗性指卡那霉素抗性。

10、所述的重组酶包括但不限于cre重组酶、flpe重组酶或dre重组酶。

11、所述的重组酶识别位点优选为loxs位点、frt或roxp。具体地，所述的cre重组酶识别loxs位点，所述的flpe重组酶识别frt，所述的dre重组酶识别roxp。

12、优选地，所述的重组酶选自cre重组酶，识别位点可以是loxs位点，能被重组酶识别并重组，所述的loxs位点包括但不限于lox2272、loxn或lox511。

13、步骤(3)中所述的利用重组酶删除抗性筛选标记的方法包括但不限于体外cre同源重组和大肠杆菌sw106 cre同源重组。

14、优选地，所述的方法中包括：

15、s1、敲除腺病毒复制关键基因的admax系统腺病毒骨架载体，插入与目的基因具有同源臂的含抗性筛选标记2的表达框，抗性筛选得到空载体；

16、s2、构建载体插入片段：重组酶识别位点-抗性筛选标记1-重组酶识别位点-目的基因；所述的片段两端包含目的基因同源臂；

17、s3、步骤s2构建的载体插入片段插入步骤s1构建的空载体，替换含抗性筛选标记2的表达框，然后进行抗性条件筛选得到抗性标记载体；

18、s4、重组酶删除抗性标记载体的抗性筛选标记1。

19、根据以上优选方案，在一些具体实施例中，本发明所述的人腺病毒had5c改造方法包括以下步骤：

20、首先对于had5c的gene x，先构建用于阳性筛选的anbiotic a(非氨苄抗性)的表达框，在lb平板上验证其功能正常后，设计引物primer1-f，primer1-r使其分别携带50nt左右(40-60nt)同源臂，与gene x上下游序列同源，这样通过将pbhglox(delta)e13cre与含有同源臂的anbiotic a表达框共转sw102感受态细胞，并涂布anbiotic a平板对其进行筛选，仅成功将anbiotic a插入pbhglox(delta)e13cre中替换gene x的克隆能够生长，进一步通过测序证明序列的完整性后可得到pbhglox(delta)e13cre-a-δx载体。

21、由于pbhglox(delta)e13cre自身携带一个loxp位点，该位点不能被cre酶识别，而其他位点如lox2272、loxn、lox511等，能够被cre酶所识别并重组。利用其他载体如pcdna3.1+构建，将基因loxs-antibiotic b-loxs-modified gene x(合成或构建)插入pcdna3.1+中，并利用antibiotic b进行筛选验证其功能正常，然后设计引物primer2-f，primer2-r使其携带50nt左右(40-60nt)同源臂，与gene x上下游序列同源，扩增出loxs-antibiotic b-loxs-modified gene x插入序列，并与pbhglox(delta)e13cre-a-δx载体共转sw102感受态，涂布antibiotic b抗性平板进行筛选并测序，阳性克隆即为gene x改造后的腺病毒载体pbhglox(delta)e13cre-loxs-b-loxs-modified genex。

22、此时获得的改造后gene x腺病毒骨架中携带有antibiotic b表达框(～1kbp)，一方面减少了后续多基因改造的筛选备选抗性基因，另一方面pbhglox(delta)e13cre载体的容量有限，经过多轮筛选后无效的抗性基因序列在腺病毒骨架中大小不可忽略，会影响后续外源基因的插入，因此需要将抗性基因进行敲除，这时就需要利用cre重组酶将两个loxs之间的抗性基因进行删除，主要有两种方式，体外cre同源重组和大肠杆菌sw106 cre同源重组。

23、体外cre同源重组：直接将pbhglox(delta)e13cre-loxs-b-loxs-modified genex载体取2.5μg(50μl体系)加入1unit cre重组酶(neb)37℃酶切30min，70℃失活10min，然后取5ng转化stbl3感受态细胞，通过菌落pcr鉴定抗性基因b的删除情况，并对删除的克隆进行测序，即可得到删除antibiotic b的gene x改造后的腺病毒载体pbhglox(delta)e13cre-loxs-modified gene x。

24、大肠杆菌sw106 cre同源重组：直接转化sw106感受态细胞，将sw106感受态细胞在阿拉伯糖诱导后可表达cre重组酶对两个loxs位点间的抗性基因b进行删除，通过菌落pcr筛选antibiotic b删除的克隆并测序，同样可得到删除antibiotic b的gene x改造后的腺病毒载体pbhglox(delta)e13cre-loxs-modified gene x。

25、最后将得到的gene x改造后的腺病毒载体pbhglox(delta)e13cre-loxs-modified gene x与admax系统的穿梭载体pdc316共转到293a细胞中即可获得gene x完成改造后的腺病毒骨架。

26、又一方面，本发明公开了上述方法在制备人腺病毒had5c重组病毒中的应用。

27、又一方面，本发明公开了一种通过上述方法制备的人腺病毒had5c重组载体，所述的载体包括cd19t基因，所述的cd19t基因为seq id no.9所示的核苷酸序列。

28、又一方面，本发明公开了上述载体的制备方法，所述的方法包括以下步骤：

29、(1)构建载体plq-35(pdc316-lox2272-kana)；

30、(2)扩增pleo-cd19t基因，与步骤(1)制备的plq-35载体进行同源重组，制备得到plq-36(pdc316-lox2272-kana-lox2272-pleo-cd19t)载体；

31、(3)利用重组酶删除步骤(2)构建的载体中的kana抗性基因，得到plq-44((pbhglox(delta)e13cre)-lox2272pleo-cd19t-bgh)载体。

32、又一方面，本发明提供了上述人腺病毒had5c重组载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

33、所述的应用包括但不限于与car t细胞联用，优选为cd19-car t细胞。

34、又一方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物，所述的药物包括上述人腺病毒had5c重组载体。

35、具体地，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。

36、所述的药学上可接受的辅料包括但不限于溶剂、乳化剂、崩解剂、增溶剂、抗氧剂、ph调节剂、渗透压调节剂、抑菌剂、稀释剂、润湿剂、粘合剂、成膜剂等。

37、与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

38、(1)本发明提供了一种人腺病毒had5c改造方法，避免了阴性筛选效率低耗时长的缺点，筛选得到阳性载体后，进一步将抗性基因敲除，不影响外源基因的插入与表达。

39、(2)本发明将pleo-cd19t基因插入到pbhglox(delta)e13creδe3处获得的plq-44载体，包装腺病毒后与cd19-car t联用治疗肿瘤具有更好的效果，为肿瘤的治疗提供了新的思路与方法。