一种重组胶原蛋白及其表达方法和应用与流程

本发明属于生物化工，具体涉及一种重组胶原蛋白及其表达方法和应用。

背景技术：

1、胶原蛋白是动物体中普遍存在的生物大分子蛋白，约占哺乳动物体内蛋白质总量的25％～30％，存在于不同组织中，包括肌肉骨骼组织，如骨骼、肌腱和韧带等，以及非肌肉骨骼组织，包括角膜、血管和皮肤。

2、胶原蛋白家族包括含有至少一个三螺旋结构域的28个成员，它们通过几个受体家族与细胞相互作用，调节细胞的增殖、迁移和分化。其共同特征是具有一个三螺旋结构，组成三螺旋结构的肽链称为α链。三条链可以相同形成同源三聚体，也可以不同，形成异源三聚体。

3、i型胶原蛋白具有胶原蛋白家族中典型的特征：一段具有(gly-x-y)重复序列的三聚体结构，x和y通常分别是脯氨酸和4-羟基脯氨酸。i型胶原蛋白是由两条相同的α1链和一条α2链构成，多肽链之间以右手螺旋构型交互缠绕成超螺旋结构，由于重复序列与链间的氢键和静电相互作用，得以形成一个稳定的三螺旋结构。

4、胶原蛋白在医药领域、食品领域以及美容领域等都有广泛的应用，因其生物相容性以及生物可降解性等诸多优点，使其能够作为医用生物材料以及用于美容等，例如用于皮肤烫伤、烧伤，防止细菌感染、缓和伤痛、制成注射用溶液以达到美容效果、作为药物载体、骨骼、支架材料、心脏瓣膜等。目前胶原蛋白仍有很多探索研究，例如通过测定器官中胶原蛋白含量来预测纤维化，也可合并其他药物作为潜在诊断生物标志物和治疗靶点、介导细胞迁移等，有望拓展其前沿的应用。

5、胶原蛋白的提取方法多种多样，目前多以酸法、碱法以及酶法提取动物源胶原蛋白为主，可得到胶原蛋白完整的三螺旋结构以保持其生物学特性，具有成本低、经济价值高等优点，但目前动物源胶原蛋白仍然存在免疫原性、均一性差、传染病隐患等多个弊端，而通过基因工程技术制备的重组胶原蛋白相比较动物源胶原蛋白降低了排斥反应、免疫原性以及病毒感染的风险，是目前解决胶原蛋白来源问题最有潜力的方法，因此重组胶原蛋白是目前胶原蛋白生产研究的一大热点。

6、现多采用大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母等制备表达胶原蛋白，但大肠杆菌难以表达可溶性胶原蛋白以及表达多肽过程中易形成包涵体，纯化难度较高。全长的胶原蛋白分子量较大，且具有多种翻译后修饰。酵母系统中对胶原蛋白的翻译后修饰与人体中差异较大，难以替代人体全长胶原蛋白。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重组胶原蛋白及其表达方法和应用，显著提高重组胶原蛋白表达量，且重组胶原蛋白具有很好的促进细胞迁移的活性和稳定性。

2、本发明提供了一种重组胶原蛋白，包括iii型人胶原蛋白的全部或者部分氨基酸序列和i型人胶原蛋白的全部或者部分氨基酸序列。

3、优选的，所述iii型人胶原蛋白的部分氨基酸序列包括iii型人胶原蛋白氨基酸序列的第847～849位氨基酸序列或者第154～1221位氨基酸序列；

4、所述i型人胶原蛋白氨基酸的部分氨基酸序列包括i型人胶原蛋白α2氨基酸的第80～1119位氨基酸序列。

5、优选的，所述重组胶原蛋白的结构中还包括分泌标签、组氨酸标签、融合标签和蛋白酶切割位点序列。

6、优选的，所述分泌标签选自：胰蛋白酶、人白介素2、血清白蛋白、二硫键形成蛋白a、果胶酸裂合酶b、外膜蛋白a、麦芽糖结合蛋白、胞壁质脂蛋白、三甲胺n氧化物还原酶、甘露糖苷酶、人胰岛素或杂交分泌标签；

7、所述融合标签选自：麦芽糖结合蛋白、半胱氨酸蛋白酶、谷胱甘肽巯基转移酶、载脂蛋白a1、硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白或杂交融合标签；

8、所述蛋白酶切割位点序列选自：烟草蚀纹病毒酶切序列、凝血酶切序列、肠激酶切序列、因子xa酶切序列、鼻病毒3c酶切序列或杂交酶切割位点序列。

9、优选的，所述重组胶原蛋白包括seq id no.1所示的氨基酸序列。

10、本发明还提供了一种包含上述重组胶原蛋白的编码基因的重组表达载体。

11、优选的，所述编码基因包括如seq id no.24所示的核苷酸序列。

12、本发明还提供了上述重组胶原蛋白的表达方法，将上述重组表达载体转化人胚胎肾细胞expi293f后，进行培养和表达。

13、本发明还提供了上述重组胶原蛋白或利用上述表达方法得到的重组胶原蛋白在制备促进细胞迁移活性产品中的应用。

14、本发明还提供了上述重组胶原蛋白或利用上述表达方法得到的重组胶原蛋白在制备皮肤修复产品中的应用。

15、有益效果：本发明提供了一种重组胶原蛋白，将iii型人胶原蛋白和i型人胶原蛋白α2氨基酸序列进行拼接。本发明采用人胚胎肾细胞expi293f表达所述重组胶原蛋白，蛋白表达量高，实现了大分子量重组胶原蛋白的表达。

16、本发明还通过活性研究表明，所表达的重组胶原蛋白具有很好的促进细胞迁移的活性，且在4℃具有良好的稳定性。

技术特征：

1.一种重组胶原蛋白，其特征在于，包括iii型人胶原蛋白的全部或者部分氨基酸序列和i型人胶原蛋白的全部或者部分氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述重组胶原蛋白，其特征在于，所述iii型人胶原蛋白的部分氨基酸序列包括iii型人胶原蛋白氨基酸序列的第847～849位氨基酸序列或者第154～1221位氨基酸序列；

3.根据权利要求1所述重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的结构中还包括分泌标签、组氨酸标签、融合标签和蛋白酶切割位点序列。

4.根据权利要求3所述重组胶原蛋白，其特征在于，所述分泌标签选自：胰蛋白酶、人白介素2、血清白蛋白、二硫键形成蛋白a、果胶酸裂合酶b、外膜蛋白a、麦芽糖结合蛋白、胞壁质脂蛋白、三甲胺n氧化物还原酶、甘露糖苷酶、人胰岛素或杂交分泌标签；

5.根据权利要求3或4所述重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白包括seq idno.1所示的氨基酸序列。

6.一种包含权利要求1～5任一项所述重组胶原蛋白的编码基因的重组表达载体。

7.根据权利要求7所述重组表达载体，其特征在于，所述编码基因包括如seq id no.24所示的核苷酸序列。

8.权利要求1～5任一项所述重组胶原蛋白的表达方法，其特征在于，将权利要求6或7所述重组表达载体转化人胚胎肾细胞expi293f后，进行培养和表达。

9.权利要求1～5任一项所述重组胶原蛋白或利用权利要求8所述表达方法得到的重组胶原蛋白在制备促进细胞迁移活性产品中的应用。

10.权利要求1～5任一项所述重组胶原蛋白或利用权利要求8所述表达方法得到的重组胶原蛋白在制备皮肤修复产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种重组胶原蛋白及其表达方法和应用，属于生物化工技术领域。本发明提供了一种重组胶原蛋白，将III型人胶原蛋白和I型人胶原蛋白α2氨基酸序列进行拼接。本发明采用人胚胎肾细胞Expi293F表达所述重组胶原蛋白，蛋白表达量高，实现了大分子量重组胶原蛋白的表达。本发明还通过活性研究表明，所表达的重组胶原蛋白具有很好的促进细胞迁移的活性，且带有融合标签的重组胶原蛋白III+I在4℃具有良好的稳定性。此外，细胞活性研究表明，人源细胞表达的重组III型胶原蛋白比市售的III型胶原蛋白具有更好的促进细胞迁移的活性。这些结果说明，人源细胞表达系统有利于高活性、大分子量重组胶原蛋白的表达。

技术研发人员：郭志栋,邵佳佳,马红伟,艾华伟
受保护的技术使用者：山东多美康生物医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15