一种用于真菌联检的组合物及含其的试剂盒与应用的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种用于真菌联检的组合物及含其试剂盒与应用。

背景技术：

1、据报道器官移植和恶性肿瘤患者中真菌感染的患病率高达20％-40％，且往往是致命性感染，侵袭性真菌病(invasive fungal disease，ifd)即侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection，ifi)，占医院获得性感染的8％-15％，病死率高。

2、组织胞浆菌是一种双向性真菌，有三个变种：荚膜变种(h.capsulatumvar.capsulatum)、杜波氏变种(h.capsulatum var.duboisii)和伪皮疽变种(h.capsulatumvar.farciminosum)。组织胞浆菌病是由荚膜组织胞浆菌引起的肺部和血液感染性疾病，感染患者最常见潜在疾病是hiv/aids(22.0％)和糖尿病(10.4％)，第三是肝脏疾病(7.5％)，常表现为发病急、病情进展迅速，治疗不及时，死亡率高，且组织胞浆菌培养阳性率低，临床诊断较为困难。

3、赛多孢子菌(scedosporium)属主要包含两种：尖端赛多孢子菌(scedosporiumapiospermum)和多育赛多孢子菌(scedosporium prolificans)，在土壤、污水、腐物等受污染的环境中广泛存在，可侵犯人体的多种器官导致多种疾病形式。最常见的感染部位是肺。临床显示，在免疫功能低下的宿主中，赛多孢菌占器官移植受体中所有非曲霉菌感染的25％；a.rougeron研究表明，在囊性纤维化(cf)患者气道定植的丝状真菌中排名第二。

4、曲霉(aspergillus)属丝状真菌，是一种常见的条件致病性真菌，主要经呼吸道感染肺部，也可侵犯皮肤、黏膜，严重者可发生败血症。常见的致病菌包括烟曲霉、黄曲霉、土曲霉等，其中烟曲霉是侵袭性曲霉菌，多发于重症或免疫功能低下的患者中，起病时缺乏典型临床表现。且赛多孢菌与曲霉感染组织学上不易相区别。

5、毛霉目真菌(mucorales)在自然界中广泛存在，可通过人体吸入、摄入或外伤后接触引发机会性感染，导致毛霉病(mucormycosis)的发生。近年来毛霉病的发病率快速跃升，毛霉病已经成为继曲霉菌感染外第二多见的致病霉菌，可在恶性肿瘤和移植术后的患者中引发侵袭性的真菌感染。

6、荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉、毛霉四种真菌侵袭力强、治疗时间长、预后差，死亡率高。因此早期确诊，及早治疗是提高治愈率的关键。目前实验室常规用的检测手段如染色镜检、真菌培养等，耗时长，操作复杂，且需专业人士才能准确判断结果。

7、现有技术大多针对真菌的保守区域设计引物和探针，以扩大真菌的检测范围。但所得扩增产物中包含多种真菌的基因或核苷酸片段，无法区分具体真菌的种类，仅可用作快速检测待测样本中是否存在某些真菌，却无法鉴定具体的真菌种类，例如荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和/或毛霉菌等。

技术实现思路

1、为了克服现有技术缺陷，本发明基于多重荧光定量pcr技术设计了一种真菌联检组合物及含其试剂盒，以实现荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和/或毛霉菌的快速、准确鉴定。

2、多重pcr(multiplex polymerase chain reaction，mpcr)是指通过一次pcr反应同时对多个靶标进行扩增，结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。多重pcr是在普通pcr的基础上，在同一个反应体系中加入不同的引物对，针对不同的模板或同一模板的不同区域进行特异性的扩增，从而得到多个目的片段，结合一定的检测手段进而实现同时对多个靶标进行诊断的技术。

3、多重荧光定量pcr(multiple fluorescencequantitative pcr)技术是在荧光定量pcr技术的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。taqman水解探针(hydrolysis probes)是多重荧光pcr体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的taqman水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。

4、本发明实现技术目的的技术方案如下所示：

5、本发明第一方面提供了一种用于真菌联检的组合物，所述组合物包括以下至少两种核酸组合物：

6、第一核酸组合物：如seq id no:1所示的检测荚膜组织胞浆菌的上游引物、seqidno:2所示的检测荚膜组织胞浆菌的下游引物和seq id no:3所示的检测荚膜组织胞浆菌的第一核酸探针；

7、第二核酸组合物：如seq id no:4所示的检测赛多孢子菌的上游引物、seq id no:5所示的检测赛多孢子菌的下游引物和seq id no:6所示的检测赛多孢子菌的第二核酸探针；

8、第三核酸组合物：如seq id no:7所示的检测曲霉菌的上游引物、seq id no:8所示的检测曲霉的下游引物和seq id no:9所示的检测曲霉菌的第三核酸探针；

9、第四核酸组合物：如seq id no:10所示的检测毛霉菌的上游引物、seq id no:11所示的检测毛霉菌的下游引物和seq id no:12所示的检测毛霉菌的第四核酸探针。

10、本发明提供的真菌联检组合物可以用于检测荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和毛霉菌中的至少两种真菌。

11、在一些实施方式中，所述组合物可以用于检测荚膜组织胞浆菌和赛多孢子菌。

12、在一些实施方式中，所述组合物可以用于检测荚膜组织胞浆菌和曲霉菌。

13、在一些实施方式中，所述组合物可以用于检测荚膜组织胞浆菌和毛霉菌。

14、在一些实施方式中，所述组合物可以用于检测荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌和曲霉菌。

15、在一些实施方式中，所述组合物可以用于检测荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌和毛霉菌。

16、在一些实施方式中，所述组合物可以用于检测荚膜组织胞浆菌、曲霉菌和毛霉菌。

17、在一些实施方式中，所述组合物可以用于检测赛多孢子菌、曲霉菌和毛霉菌。

18、在一些实施方式中，所述组合物可以用于检测荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和毛霉菌。

19、在一些具体的实施方式中，所述组合物包括以下四种核酸组合物：

20、第一核酸组合物：如seq id no:1所示的检测荚膜组织胞浆菌的上游引物、seqidno:2所示的检测荚膜组织胞浆菌的下游引物和seq id no:3所示的检测荚膜组织胞浆菌的第一核酸探针；

21、第二核酸组合物：如seq id no:4所示的检测赛多孢子菌的上游引物、seq id no:5所示的检测赛多孢子菌的下游引物和seq id no:6所示的检测赛多孢子菌的第一核酸探针；

22、第三核酸组合物：如seq id no:7所示的检测曲霉菌的上游引物、seq id no:8所示的检测曲霉的下游引物和seq id no:9所示的检测曲霉菌的第一核酸探针；

23、第四核酸组合物：如seq id no:10所示的检测毛霉菌的上游引物、seq id no:11所示的检测毛霉菌的下游引物和seq id no:12所示的检测毛霉菌的第一核酸探针。

24、在一些实施方式中，所述第一核酸探针、第二核酸探针、第三核酸探针和第四核酸探针可以为在5’端和3’端分别经第一标记物和第二标记物标记的单链dna探针或单链rna探针。

25、在一些具体的实施方式中，所述核酸探针为单链dna探针。

26、在一些实施方式中，所述第一标记物和第二标记物选自荧光基团对和淬灭基因对；

27、所述第一核酸探针、第二核酸探针、第三核酸探针和第四核酸探针的荧光基团互不相同且互不干扰。

28、在一些实施方式中，所述荧光基团选自fam、vic、tet、hex、joe、cy5和rox。

29、在一些实施方式中，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、tamra和dabcyl。

30、在一些具体的实施方式中，所述第一核酸探针的荧光基团可以为fam；所述第二核酸探针的荧光基团可以为hex或vic；所述第三核酸组合物中所述核酸探针的荧光基团可以为rox；所述第四核酸组合物中所述核酸探针的荧光基团可以为cy5。

31、在一些具体的实施方式中，所述第一核酸探针的淬灭基团可以为bhq1；所述第二核酸探针的淬灭基团可以为bhq1；所述第三核酸探针可以为bhq2；所述第四核酸探针可以为淬灭基团为bhq2。在一些实施方式中，所述组合物还包括内标基因的上游引物和下游引物和内标探针。

32、在一些实施方式中，所述内标基因包括gapdh、b2m、18s rna、β-actin等。

33、本发明第二方面提供一种真菌联检试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的组合物。

34、在一些实施方式中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntps、尿嘧啶-n-糖基化酶、dna聚合酶、缓冲液和含镁离子的溶液中的至少一种。

35、本发明第三方面提供一种第一方面所述的组合物和/或第二方面所述的试剂盒在制备真菌联检试剂中的应用。

36、在一些实施方式中，所述真菌选自荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和毛霉菌中的至少两种。

37、在一些实施方式中，所述真菌可以为荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和毛霉菌。

38、本发明第四方面提供一种用于非诊断目的的真菌联检的方法，所述方法包括以下步骤：

39、(1)提取或释放待测样本的核酸；

40、(2)使用第一方面所述的组合物和/或第二方面所述的试剂盒对步骤(1)获得的核酸进行荧光定量pcr分析；

41、(3)获得扩增结果并进行分析。

42、在一些实施方式中，所述真菌选自荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和毛霉菌中的至少两种。

43、在一些实施方式中，所述真菌可以为荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和毛霉菌。

44、相对于现有技术，本发明提供的组合物和/或试剂盒至少具有以下有益效果：

45、(1)组合物之间彼此无干扰，即使在同一扩增体系中仍可实现特异性扩增；

46、(2)可实现荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、曲霉菌和毛霉菌中至少两种真菌的精准鉴定；

47、(3)组合物的灵敏度高，检测最低限为500copies/ml；

48、(4)组合物的特异性强，无非特异性扩增；

49、(5)组合物的抗干扰性和稳定性佳，不受样本中其他物质的干扰，依然可以实现特异性扩增。