一种检测人鼻病毒分型的引物组合、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及分子诊断，特别涉及一种检测人鼻病毒分型的引物组合，检测人鼻病毒分型试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、人鼻病毒(humanrhinovirus，hrv)是小rna病毒科、肠道病毒属的一种，是人患普通感冒的主要病原。hrv感染在全球范围内各个季节均可发生，但在春季和秋季尤其明显，据报道在此流行季节超过10％～25％的儿童急性上呼吸道感染与hrv有关。hrv感染后一般表现为普通感冒症状，但不同型别hrv感染后的疾病严重程度不同，也可能与其他病毒混合感染。

2、hrv核心为单股正链线性rna，全长7200bp左右，外有蛋白衣壳，无包膜，病毒直径为27～30nm，壳体由vp1、vp2、vp3、vp4四种结构蛋白组合成相同的60个壳粒，呈二十面立体对称结构围绕着核心rna。hrv分为5'非编码区(5'-untranslatedregion，utr)、开放性阅框(orfs)和3'非编码区(3'-untranslatedregion，utr)，5'utr尽管只有大约650bp，但它对于病毒的复制和翻译等功能起到至关重要的作用，且有研究发现5'utr与hrv的毒力相关。orfs长约6500bp(编码含2200个氨基酸的多聚蛋白)分成p1、p2、p3区域，p1区编码的vp1蛋白是产生保护性抗体的主要抗原；p2、p3区为病毒的非结构区域，主要编码产生蛋白酶、聚合酶以及一些病毒复制感染相关的蛋白、病毒多聚蛋白，p3区编码蛋白对病毒rna的复制具有重要作用。3'utr的长度约为47～341nt，含有与病毒翻译和复制调控有关的重要元件。

3、到目前为止，hrv病毒已经被分成100多个血清型，构成了血清型总数最高的人类感染病毒，主要被分为三个大类，hrv-a、hrv-b和hrv-c。全球范围内hrv三种亚型均有流行，且在各个年龄层中均有分布，然而相对于hrv-c和hrv-a，hrv-b的检出率较低。研究发现大部分的hrv-a和hrv-b与呼吸道上皮细胞表面的细胞间黏附因子(intercellularadhesionmolecule-1，icam-1)特异性结合，少部分与极低密度脂蛋白受体相结合(vldl-r)。但hrv-c的受体目前尚未被发现。随着对hrv不断的深入研究，发现不同型别hrv与疾病之间存在一定的联系，例如hrv-c与急性哮喘关系比hrv-a和hrv-b更为密切。由于hrv抗原性复杂，感染后可获得免疫力，但维持时间短，人可多次患感冒。尽管在hrv研究领域已经取得了重大的进展，明确其与呼吸道疾病相关，但目前对普通感冒尚无特异高效预防手段和治疗方法，且hrv感染人体的致病机制仍需进一步研究，因此对hrv进行分型检测对临床医生指导用药，以及鼻病毒感染的病理研究具有重要意义。

4、hrv的检测方法主要有组织培养法、血清抗体检测法及分子生物学诊断等，组织培养步骤复杂，所需时间较长，不适合临床样本快速诊断；血清抗体检测灵敏度和特异性不高，以上两种传统的检测hrv分型的方法因其各方面的限制，正逐渐被淘汰；分子生物学诊断方法在hrv等呼吸道病毒的检测应用方面具有灵敏性高、快速、方便的优点，也是目前应用最多的检测人鼻病毒分型的方法。现有技术检测hrv分型时，多数采用多重pcr的方法，在多条引物和探针下同时进行检测，而多条引物或探针之间存在相互干扰，容易导致引物二聚体、假阳性等问题。

5、有必要开发一种特异性强，分型准确的新的hrv分型方法。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于提供一种检测人鼻病毒分型的巢式pcr引物。

2、本发明的另一目的在于提供一种检测人鼻病毒分型的方法。其具有特异性强、灵敏度和准确度高的特点，适用于人鼻病毒分型的临床检测，具有重要科学研究意义。

3、本发明的再一目的在于提供一种检测人鼻病毒分型的试剂盒。

4、本发明的目的是通过下述技术方案实现：

5、一种检测人鼻病毒的引物组合，所述引物组合包括巢式pcr引物，所述巢式pcr引物包括一对外侧引物hrv1--f、hrv1-r，和一对内侧引物hrv2-f、hrv2-r，其引物序列如seqid no.1～4所示：

6、hrv1-f：5'-gagastcctccggcccctgaat-3'(seq id no.1)

7、hrv1-r：5'-gaaantydtccancatcdtgag-3'(seq id no.2)

8、hrv2-f：5'-ctactttgggtgtccgtgtttc-3'(seq id no.3)

9、hrv2-r：5'-aadscatcwggharyttccaac-3'(seq id no.4)

10、seq id no.1～4所示的核苷酸序列中的s、n、y、d、w、h、r为简并碱基，其中s为g/c，n为a/t/c/g，y为c/t，d为a/g/t，w为a/t，h为a/t/c，r为a/g，这是本领域通用的表示方法。

11、本发明还提供一种检测人鼻病毒分型的引物组合，所述引物组合包括巢式pcr引物和一对测序引物m13f、m13r，所述巢式pcr引物包括一对外侧引物hrv1--f、hrv1-r，和一对内侧引物hrv2-f、hrv2-r，其引物序列如seq id no.1～4所示：

12、hrv1-f：5'-gagastcctccggcccctgaat-3'(seq id no.1)

13、hrv1-r：5'-gaaantydtccancatcdtgag-3'(seq id no.2)

14、hrv2-f：5'-ctactttgggtgtccgtgtttc-3'(seq id no.3)

15、hrv2-r：5'-aadscatcwggharyttccaac-3'(seq id no.4)

16、测序引物m13f、m13r的引物序列如seq id no.5～6所示：

17、m13f：tgtaaaacgacggccagt(seq id no.5)

18、m13r：aacagctatgaccatg(seq id no.6)。

19、本发明在人鼻病毒保守区域vp4/vp2设计引物，可以实现对人鼻病毒不同亚型进行扩增。人鼻病毒变异性大，本发明引进了简并碱基(混合碱基)，以保证不同亚型在引物区域发生碱基突变时能更好地与模板结合，提高检测人鼻病毒的准确性和特异性。

20、本发明还提供一种检测人鼻病毒的巢式pcr试剂盒，包括上述检测人鼻病毒的引物组合，即包括巢式pcr引物。

21、本发明还提供一种检测人鼻病毒分型的巢式pcr试剂盒，包括上述检测人鼻病毒分型的引物组合，即包括巢式pcr引物和测序引物。

22、进一步，所述检测人鼻病毒的巢式pcr试剂盒包括检测体系pcr扩增反应液，所述检测体系pcr扩增反应液包括巢式pcr引物，即包括一对外侧引物hrv1--f、hrv1-r，和一对内侧引物hrv2-f、hrv2-r。

23、进一步，所述检测人鼻病毒分型的巢式pcr试剂盒包括检测体系pcr扩增反应液、测序体系反应液，所述检测体系pcr扩增反应液包括巢式pcr引物，即包括一对外侧引物hrv1--f、hrv1-r，和一对内侧引物hrv2-f、hrv2-r，所述测序体系反应液包括一对测序引物m13f、m13r。

24、所述检测体系pcr扩增反应液中，所述外侧引物hrv1--f、hrv1-r，内侧引物hrv2-f、hrv2-r的浓度相同，均为1～10um，优选均为10um。

25、进一步，所述检测体系pcr扩增反应液还包括10xpcrbuffer，5xq-solution、dntps和taqdna聚合酶。

26、所述测序体系反应液还包括edta、无水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。

27、进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液，所述测序纯化液包括核酸外切酶i和牛小肠碱性磷酸酶。

28、优选地，所述检测人鼻病毒的巢式pcr试剂盒或种检测人鼻病毒分型的巢式pcr试剂盒还包括病毒rna提取试剂和病毒rna反转录试剂盒。用于待测样本的病毒rna并转录成cdna。

29、或者采用市售的核酸提取试剂盒提取待测样本的病毒rna，采用市售的病毒rna反转录试剂盒进行rna的反转录。

30、优选地，所述试剂盒还包括阴性对照品为ddh2o。

31、本发明还提供所述检测人鼻病毒的巢式pcr试剂盒在在检测人鼻病毒中的应用。

32、本发明还提供所述检测人鼻病毒分型的巢式pcr试剂盒在检测人鼻病毒、并进行病毒分型中的应用。

33、本发明还提供一种检测人鼻病毒的方法，所述方法为利用检测人鼻病毒的巢式pcr试剂盒，对待测样本进行两轮pcr扩增，扩增出500～750bp的电泳条带时，判定待测样本中存在鼻病毒。

34、本发明还提供一种检测人鼻病毒分型的方法，所述方法为利用检测人鼻病毒分型的巢式pcr试剂盒，对待测样本进行两轮pcr扩增，扩增出500～750bp的电泳条带，对第二轮pcr扩增产物进行测序并分型。

35、进一步，所述检测人鼻病毒的方法包括如下步骤：

36、(1)提取待测样本病毒rna并反转录成cdna；

37、(2)巢式pcr扩增：以步骤(1)获得的cdna为模板，利用外侧引物hrv1-f和hrv1-r进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物；然后以第一轮pcr扩增产物为模板，利用内侧引物hrv2-f和hrv2-r进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物；将第二轮pcr扩增产物进行凝胶电泳，扩增出500～750bp的电泳条带时，判定待测样本中存在鼻病毒，未得到500～750bp的电泳条带时，则判定阴性。

38、所述检测人鼻病毒分型的方法包括以下步骤：

39、(1)提取待测样本病毒rna并反转录成cdna；

40、(2)巢式pcr扩增：以步骤(1)获得的cdna为模板，利用外侧引物hrv1-f和hrv1-r进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物；然后以第一轮pcr扩增产物为模板，利用内侧引物hrv2-f和hrv2-r进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物；将第二轮pcr扩增产物进行凝胶电泳，扩增出500～750bp的电泳条带时，判定待测样本中存在鼻病毒；

41、(3)第二轮pcr扩增产物进行纯化，所得纯化产物利用测序引物m13f和m13r进行正、反向测序，获得扩增产物的基因序列；

42、(4)对测序获得的基因序列进行序列比对、确定人鼻病毒亚型。

43、所述步骤(2)中，优选第一轮pcr扩增的反应体系如下：反应总体系20μl，10xpcrbuffer2μl，2xdntp2μl，qsolution4μl，引物hrv1-r(10μm)0.5μl，引物hrv1-r(10μm)0.5μl，hotstartaqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl，rnaseddh2o8.8μl，步骤(1)获得的cdna模板2μl。

44、巢式pcr第一轮扩增程序为：94℃15min；95℃30s，51℃30s，72℃40s，40循环；72℃10min，4℃保温。

45、所述步骤(2)中，优选第二轮pcr扩增的反应体系如下：反应总体系20μl，10xpcrbuffer2μl，2xdntp2μl，qsolution4μl，引物hrv2-f(10μm)0.5μl，引物hrv2-r(10μm)0.5μl，hotstartaqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl，rnaseddh2o9.8μl，第一轮pcr的扩增产物为模板1μl。

46、巢式pcr第二轮扩增程序为：94℃15min；95℃30s，54℃30s，72℃40s，40循环；72℃10min，4℃保温。

47、所述步骤(2)中，所述凝胶电泳一般为1.5％琼脂糖凝胶电泳。

48、所述步骤(3)中，纯化采用测序纯化液进行纯化。

49、所述纯化反应程序为：37℃50min，95℃5min，4℃保温。

50、所述测序纯化液包括核酸外切酶i:0.6u、牛小肠碱性磷酸酶:1.2u。

51、所述步骤(3)中，测序体系如下：反应总体系5μl，包括纯化产物1μl，测序引物m13f(3.2um)1μl，m13r(3.2um)1μl，bigdyeterminatorv3.11μl，ddh2o1μl。所述测序反应程序为：94℃4min；95℃15s，50℃20s，60℃2min，25循环；4℃保温。

52、成测序反应的产物经过洗涤后加入高度去离子甲酰胺(hidi)变性，变性试验步骤为：95℃，5min；接着在-30℃2min，然后在4℃保存。变性程序结束后，上测序仪测序。

53、所述步骤(4)中，待测样本序列长度在500～750bp范围内。

54、所述步骤(4)中，一般使用lasergene中的seqman程序，使用blast工具，利用ncbi的病毒数据库，进行序列比对，确定人鼻病毒亚型。

55、本发明具有以下优点及有益效果：

56、非vp4/vp2区域设计的引物可能会因为样本rna质量不高或样本有所降解而导致巢式pcr扩增失败，无法获得样本基因序列进行分型；本发明在人鼻病毒的vp4/vp2区域设计引物，针对引物区有碱基突变处进行了碱基简并设计，能特异性得结合到不同亚型的基因片段上。

57、本发明与荧光定量法检测相比，无复杂探针设计，不存在多条引物或探针之间存在相互干扰，导致引物二聚体、假阳性等问题，巢式pcr引物设计更简单，更容易掌握，特异性强，取样量更低，简单快捷，成本低；与两轮普通pcr检测方法相比，灵敏度和准确性更高。本发明的巢式pcr扩增可在原来的普通两轮pcr基础上提高基因扩增的成功率。本发明基于一代测序平台，对检测的病毒可更准确分型，具有同时检测人鼻病毒不同亚型以及准确度高等优点，为临床治疗方案的制定提供可靠依据；同时也可应用于鼻病毒引起的疫情快速筛查分型、供临床诊断以及流行病学的研究。