抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法与流程

本发明涉及生物工程，具体的说，涉及一种抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法。

背景技术：

1、乙肝表面抗原（hbsag）是乙肝病毒的外壳蛋白，作为一种乙型肝炎病毒s基因的表达，其属于病毒包膜蛋白质的范畴，虽然其本身不具有传染性，但是在后期的疾病干预中，其属于最先出现的血清病毒抗原，基本结构和hbv模板息息相关，其与dna水平存在较大的相关性，所以对关于hbsag研究的价值进行分析。

2、hbsag本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。乙肝表面抗原检查用于判断是否感染了乙肝病毒。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。hbsag阳性只能说明这个人感染了hbv，但是不能确定这个人有没有传染性。如果需要确定患者体内的乙肝病毒是否具有传染性，还要检测其他项目。乙肝病毒的表现型是其血清亚型，由外膜主蛋白上的一些残基决定。

3、我国最常使用的测定乙肝表面抗原的方法是酶联免疫吸附试验法（elisa）、胶体金层析法（gia）。elisa灵敏度高，特异性强，重复性好，可定量和半定量，但操作步骤相对复杂，需要特殊设备，不适用于急诊和血筛。gia操作简单、方便、快速，可单人份检测，不需要特殊设备，但受限于方法学，准确性不如elisa。

4、人乙肝表面抗原检测试剂，应用的主要生物原料为一对hbsag单克隆抗体，hbsag单克隆抗体性能的优劣对人乙肝表面抗原检测试剂的准确性、灵敏度、特异性有至关重要的作用。

5、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备主要有小鼠体内诱生腹水、杂交瘤细胞体外培养及基因工程等方法。其中由于小鼠体内诱生腹水制备方法成本低、产量大、生产工艺相对简单，短期内能实现大量制备，因此被广泛应用。但此方法所得到的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体中含有多种杂质，为了获得高效价、高纯度、高特异性的抗体，必须筛选适合的纯化方法对其进行分离纯化，以满足在工业、科学研究或医疗诊断等方面的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体的制备方法，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2及其传代细胞株分别能够稳定的分泌抗人乙肝表面抗原单克隆抗体1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体2，将上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体分别经过饱和硫酸铵盐和蓝胶亲和层析处理，或protein-g层析和离子交换层析法处理后，可以有效除去杂质，得到特异性强、纯度高、效价高、稳定性好、均一性好、重复性强的单克隆抗体。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株包括抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2的制备方法，包括如下步骤：

3、（1）动物免疫

4、取6周龄的雄性balb/c小鼠3只，用人乙肝表面抗原天然蛋白作为免疫原进行免疫，对小鼠进行断尾采血，检测血清效价，达到10万以上，进行细胞融合；

5、（2）细胞融合

6、将小鼠处死，浸泡于体积浓度为75%酒精中5min，在无菌环境下摘取免疫小鼠的脾脏，研磨分散细胞，洗涤离心后获得b淋巴细胞，将b淋巴细胞和骨髓瘤细胞sp2/0按照细胞数量比5:1的比例进行混合、离心，用无血清dmem培养基清洗细胞，确保混合细胞中无血清，离心后弃上清，在37℃水浴中，在50s内匀速缓慢加入质量浓度50%peg溶液1ml，边滴加边混合，待其反应90s后，将40ml在37℃预温的无血清dmem培养基缓慢加入，保证peg彻底稀释而终止融合，1000rpm离心10min，弃去上清，用37℃预温的hat培养基重悬细胞沉淀，充分混匀，将其置于96孔细胞培养板中，放入5%二氧化碳的培养箱进行培养；

7、（3）杂交瘤细胞筛选和亚克隆

8、融合后的第三天以及第八天，分别用hat培养基更换96孔细胞培养板中1/2的培养液，第十天吸取细胞上清，即待检测细胞上清；

9、用间接elisa的方法对待检测细胞进行筛选，第一次筛选后，用hat培养基全部换培养液，反复筛选三次，挑选三次结果均为强阳性的细胞进行亚克隆，一般经过2-3次亚克隆，直至96孔板的阳性率达到100%，结束亚克隆，即得到两个抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别为抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2。

10、作为一种优化方案，

11、所述人乙肝表面抗原天然蛋白的制备方法包括如下步骤：

12、（1）低浓度peg沉淀：收集无症状人乙肝表面抗原携带者血清，用终浓度为5%的peg6000沉淀除去大颗粒和脂蛋白，于4 ℃静置2h，4000rpm离心30分钟，弃去沉淀物，留上清液；

13、（2）高浓度peg沉淀：上清液用终浓度为10%的peg6000沉淀，于4 ℃静置2h，4000rpm离心30分钟，弃去沉淀物，留上清液，得初纯人乙肝表面抗原天然蛋白；

14、（3）制备免疫亲合层析柱；

15、（4）人乙肝表面抗原的亲和层析纯化，包括如下步骤：

16、将步骤（3）制备好的免疫亲合层析柱连接于电脑紫外检测仪，免疫亲合层析柱纯化时，用于监测纯化过程中样本od280的实时变化，根据od280监测结果，收集纯化后的有效样本；

17、 ①平衡：用结合液清洗免疫亲合层析柱直至电脑紫外检测仪od280检测的第一峰回到基线，即达到平衡，结合液为10mm pbs、150mm nacl；

18、 ②上样：将步骤（2）得到的初纯人乙肝表面抗原天然蛋白上平衡后的免疫亲和层析柱，收集流出液，至电脑紫外检测仪od280检测的基线稳定；

19、 ③洗脱：加入洗脱液，洗脱液为ph 3.0的甘氨酸-盐酸溶液，待电脑紫外检测仪od280检测的基线上升时开始收集，至电脑紫外检测仪od280检测的基线下降并稳定，所收集的洗脱液用中和液调ph至7.4，经sephadex g25柱脱盐，即得人乙肝表面抗原天然蛋白，-20℃分装保存，中和液为1m ph 8.5 tris-hcl。

20、作为一种优化方案，

21、所述免疫亲合层析柱的制备方法包括如下步骤：

22、①偶联：取外购的成品介质-溴化氰预活化的琼脂糖凝胶放于砂芯漏斗中，用预冷的偶联溶液a 0-4℃洗涤，至少洗涤30min；

23、 偶联溶液a为1mm hcl；

24、②配基：取外购的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体置于偶联溶液b中洗涤，抗人乙肝表面抗原单克隆抗体偶联浓度为5-10mg/ml填料；

25、偶联溶液b为0.1m nahco3、0.5m nacl，ph8.3；

26、③将步骤①中洗涤好的介质用偶联溶液 a 稀释，并与②中洗涤好的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体等体积混合，室温20-25℃混匀2h或4℃混匀过夜，得凝胶；

27、④对凝胶进行封闭和清洗：

28、封闭：抽去偶联上清并加入封闭液，封闭液为0.1m tris-hcl，ph8.0，室温封闭2-4h；

29、清洗：用ph8-9的0.1m tris-hcl和0.5m nacl混合液与ph3-4的0.1m醋酸盐缓冲液和0.5m nacl混合液交替洗涤3-6次，每次用5倍介质体积的液体洗涤，再用pbs缓冲液清洗后得免疫亲合层析柱。

30、作为一种优化方案，

31、所述亚克隆的操作方法为：将筛选到的阳性孔，转移到新的96孔细胞培养板，采用倍比稀释法，进行亚克隆，七天后，将培养基换成含20v/v%fbs的dmem完全培养基，继续培养；8-12天后，用间接elisa的方法检测培养上清，连续进行两次筛选及亚克隆，选取细胞团单一的阳性孔，继续亚克隆，同时将每次克隆化的剩余细胞扩大培养冻存。

32、作为一种优化方案，

33、用间接elisa的方法对待检测细胞进行筛选，具体方法如下：

34、①包被：用包被液将乙肝表面抗原天然蛋白稀释成1μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，37℃2h或4℃包被过夜，用pbst缓冲液洗板5次，除去未结合的抗原及杂质，拍干酶标板；

35、包被液为ph9.6的碳酸盐缓冲液；

36、②封闭：每孔加入含1w/v%bsa的pbst缓冲液进行封闭，150μl/孔，37℃孵育2h，用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板；

37、③加待检测细胞上清：将待检测细胞上清加入到酶标板中，100μl/孔，同时用小鼠免疫血清做阳性对照，用hat培养基做空白对照，37℃水浴30min，用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板；

38、④加酶标二抗：用pbs缓冲液将hrp标记的羊抗鼠抗体1000倍稀释，加入到酶标板中，50μl /孔，37℃水浴30min，用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板；

39、⑤显色：加入tmb显色液显色，100μl/孔，37℃孵育10min；用2mol/l硫酸进行终止，50μl/孔，于酶标仪450nm波长下检测结果，检测样本od值/阴性对照od值≥2.1，即为阳性，完成一次筛选。

40、作为一种优化方案，

41、用人乙肝表面抗原天然蛋白作为免疫原进行免疫的方法为：第一次免疫剂量为80μg/只，一周后进行第二次免疫，免疫剂量为40μg/只，一周后进行第三次免疫，免疫剂量为40μg/只；三次免疫中免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化，背部腹股沟皮下多点免疫；一周后进行第四次免疫，免疫剂量为50μg/只，与等体积的无菌生理盐水混合，腹腔注射免疫；5天后，对小鼠进行断尾采血。

42、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株制备的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体1的纯化方法，包括如下步骤：

43、（1）腹水的制备：选取12周龄左右的balb/c雄鼠，每只小鼠腹腔注射0.8ml液体石蜡，5天后腹腔注射筛选的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1，数量为106个/只，注射后，密切观察小鼠状态，待其腹部膨胀明显后收集腹水，8000rpm4℃离心10min，二氧化硅吸附除去脂质，经定性滤纸过滤，收集上清；

44、（2）抗人乙肝表面抗原单克隆抗体1的纯化

45、从-20℃冰箱取出腹水，待完全融化后9000r/min离心10min，用0.45μm滤膜过滤，通过硫酸铵盐析法将腹水进行预处理，再经过蓝胶亲和层析柱进行纯化，收集纯化的抗体，用0.01m pbs缓冲液进行透析，用0.22μm滤器过滤后即为纯化后的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体1。

46、所述硫酸铵盐析法纯化的具体操作：

47、a、取1体积份腹水，加入1体积份的饱和硫酸铵溶液，使其饱和度50%，边加边搅拌，充分混匀，搅拌30min后9000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀；

48、 b、收集的沉淀中加入20mm ph7.0 pb缓冲液0.8体积份，使其完全溶解后装入透析袋，4℃条件下用pb缓冲液透析，透析48小时后，4000r/min离心20min，上清用0.22μm滤器过滤，即为初纯抗体；

49、蓝胶亲和层析纯化的具体操作：

50、a、从4℃取出装有蓝胶填料的层析柱，平衡至室温，用5倍柱体积的平衡缓冲液冲洗、平衡层析柱；

51、平衡缓冲液为20mm pb，ph7.0；

52、b、将初纯抗体加入层析柱，收集流出液，控制流速1.0ml/min，重复上样2-3次，上样结束后层析柱中加入10倍柱体积的平衡缓冲液进行冲洗，平衡层析柱，收集流出液；

53、平衡缓冲液为20mm pb，ph7.0；

54、c、向层析柱中分别加入10倍柱体积的洗脱液1、洗脱液2、洗脱液3、洗脱液4，依次进行洗脱，收集所有的洗脱液，进行sds-page纯度检测，确定纯度最优的蛋白所在的洗脱液；

55、洗脱液1为20mm pb、20mm nacl，ph7.0；

56、洗脱液2为20mm pb、50mm nacl，ph7.0；

57、洗脱液3为20mm pb、200mm nacl，ph7.0；

58、洗脱液4为20mm pb、1m nacl，ph7.0；

59、d、向层析柱中加入5倍柱体积的缓冲液，冲洗层析柱，然后再用5倍柱体积的20%乙醇溶液冲洗保存层析柱；

60、缓冲液为20mm pb、2m nacl，ph7.0；

61、e、将步骤c收集的纯度最优的蛋白所在的洗脱液装入透析袋用peg20000浓缩，将透析袋放入pbs缓冲液中透析48小时，透析结束后4000r/min离心20min，取上清用0.22μm滤器过滤后即为纯化后的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体1。

62、抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株制备的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体2的纯化方法，包括如下步骤：

63、（1）腹水的制备：选取12周龄左右的balb/c雄鼠，每只小鼠腹腔注射0.8ml液体石蜡，5天后腹腔注射筛选的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2，数量为106个/只，注射后，密切观察小鼠状态，待其腹部膨胀明显后收集腹水，8000rpm4℃离心10min，二氧化硅吸附除去脂质，经定性滤纸过滤，收集上清；

64、 （2）抗人乙肝表面抗原单克隆抗体2的纯化

65、从-20℃冰箱取出腹水，待完全融化后9000r/min离心10min，用0.45μm滤膜过滤，通过protein-g柱进行亲和层析法纯化，再经过离子交换层析法进行纯化，收集纯化的抗体，用0.01m pbs缓冲液进行透析，用0.22μm滤器过滤后即为纯化后的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体2。

66、所述protein-g亲和层析法纯化的具体操作：

67、取1体积份腹水，加入1体积份的平衡缓冲液，充分混匀，用0.45μm的微孔滤膜过滤；

68、从4℃取出装有protein-g填料的层析柱，平衡至室温，用5倍柱体积的平衡缓冲液冲洗平衡层析柱；

69、c、将过滤后的腹水加入层析柱，收集流出液，控制流速1.5ml/min，重复上样2-3次，上样结束后层析柱中加入10倍柱体积的平衡缓冲液进行洗杂，平衡层析柱，收集流出液；

70、d、向层析柱中加入10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱液，用中和液调至中性；

71、e、向层析柱中加入5倍柱体积的平衡缓冲液，冲洗平衡层析柱，然后再用5倍层析柱体积的20%乙醇溶液平衡保存层析柱；

72、f、将调至中性的洗脱液装入透析袋，将透析袋放入透析缓冲液中，4℃条件下透析48小时后，4000r/min离心20min，上清用0.22μm滤器过滤，即为初纯抗体；

73、其中，

74、平衡缓冲液为20mm na2hpo4和0.15m nacl混合液，ph7.0；

75、洗脱液为0.1m ph3.0 甘氨酸；

76、中和液为1m tris-hcl，ph8.5；

77、透析缓冲液为20mm tris-hcl，ph8.0；

78、离子交换层析法纯化的具体操作：

79、a、从4℃取出装有q-bestarose hp填料的层析柱，平衡至室温，用5倍柱体积的平衡缓冲液冲洗、平衡层析柱；

80、平衡缓冲液为20mm tris-hcl、5mm mgcl2，ph8.0；

81、b、将初纯抗体加入层析柱，收集流出液，控制流速1.2ml/min，重复上样3次，上样结束后层析柱中加入10倍柱体积的平衡缓冲液进行冲洗，平衡层析柱，收集流出液；

82、平衡缓冲液为20mm tris-hcl，ph8.0；

83、c、向层析柱中分别加入10倍柱体积的洗脱液1、洗脱液2、洗脱液3，依次进行洗脱，收集所有的洗脱蛋白，sds-page纯度检测，确定纯度最优的蛋白所在的洗脱液；

84、洗脱液1为20mm tris-hcl、50mm nacl，ph8.0，洗脱液2为20mm tris-hcl、200mmnacl，ph8.0，洗脱液3为20mm tris-hcl、1000mm nacl，ph8.0；

85、d、向层析柱中加入5倍柱体积的缓冲液，冲洗再生层析柱，然后再用5倍柱体积的20%乙醇溶液冲洗保存层析柱；

86、缓冲液为20mm tris-hcl、2000mm nacl，ph8.0；

87、e、将步骤c收集的纯度最优的蛋白所在的洗脱液装入透析袋，用peg20000浓缩，将透析袋放入pbs缓冲液中透析48小时，透析结束后4000r/min离心20min，取上清用0.22μm滤器过滤后即为纯化后的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体2。

88、本发明采取以上技术方案，具有以下优点：本发明的抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株2及其传代细胞株分别能够稳定的分泌抗人乙肝表面抗原单克隆抗体1和抗人乙肝表面抗原单克隆抗体2；将上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体分别经过饱和硫酸铵盐和蓝胶亲和层析处理，或protein-g层析和离子交换层析法处理后，可以有效除去杂质，得到特异性强、纯度高、效价高、稳定性好、均一性好、重复性强的单克隆抗体；纯化后得到的单克隆抗体用于检测试剂的生产，大大提高了试剂灵敏度和特异性。

89、下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。