一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法。

背景技术：

1、随着环境保护观念的广泛普及和认可，绿色化学品和环保工艺的重要性日益凸显。在这个背景下，研究人员旨在开发更具可持续性和环保性的化学品和工业过程，以满足人们对绿色化学品的需求以及可持续发展的战略目标。其中，生物表面活性剂具备低毒性、环保性和可生物降解等特性，成为研究和工业领域关注的焦点。

2、surfactin是一种由枯草芽孢杆菌产生的脂肽类生物表面活性剂，它是由七个氨基酸组成的环肽和含12-17个碳原子的的β-羟基脂肪酸链构成。surfactin具有独特的化学结构和生物活性，使其在许多应用领域具有重要的价值。

3、在工业生产中，野生菌产生的surfactin产量普遍较低，是限制surfactin工业化应用的主要因素之一。目前，surfactin的增产方法主要是通过优化培养条件以及对菌株进行基因改造。在优化培养条件方面，专利cn 110669811公开了将解淀粉芽孢杆菌hm-618种子液按od600为0.1～0.3接入发酵培养基中，施加一定培养条件可提高surfactin产量；随后专利cn 110699408公开了将解淀粉芽孢杆菌hm-618和枯草芽孢杆菌共培养，进一步提高surfactin产量；cn 106635869公开了应用筛选的解淀粉芽孢杆菌mt45，优化培养条件，发酵55h最高生产9.43g/l的surfactin；cn 114214252公开了在发酵培养基中添加脂肪醇及其衍生物并调节ph为弱酸性，提高surfactin的产量。另外一些研究者通过基因工程的方法对芽孢杆菌进行改造，cn 102242142、cn 102174558、cn 102220367和cn 102220366分别公开了在枯草芽孢杆菌atcc9943中过表达phrc基因、过表达coma基因、敲除abrb基因及过表达yerp基因构建了枯草芽孢杆菌fmb25、27、29和45，surfactin产量从777mg/l分别提高到了1596、1605、1091和1266mg/l；cn 103898038公开了在枯草芽孢杆菌thy-7中过表达ycxa基因，surfactin产量提高了97％；cn 110331121、cn 109097315和cn 109554321公开了在thy-7/pg3-srfa中过表达leuabcd-ilvk、过表达yngh基因、敲除spoivb基因，surfactin产量分别提高了55.6％、47％、25％。基因改造过程中的启动子改造效果较为明显，cn101402959中公开了使用iptg诱导型启动子pspac替换枯草芽孢杆菌fmbr中的psrfa启动子，在添加诱导剂时surfactin产量提高10倍；cn 105400784公开了一种强启动子pg3，替换枯草芽孢杆菌thy-7原始启动子，加入诱导型后surfactin产量提高了17.7倍。

4、然而，上述启动子工程的改造的方法均需使用诱导型启动子，化学诱导剂的引入不仅增加了成本，并且会影响surfactin在食品、化妆品等领域的应用。

技术实现思路

1、为了解决克服野生菌的surfactin产量较低，且诱导型启动子替换需要引入诱导剂的问题，本发明的目的是提供一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法。本发明运用分子生物学的方法将原始菌株的psrfa启动子部分序列替换为phema启动子，本发明构建的工程菌株强化surfactin合成途径，显著提高了枯草芽孢杆菌的surfactin产量，并且相比于诱导型启动子，组成型启动子做表达时无需添加诱导剂，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有潜在的工业应用价值。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的第一个目的是提供一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株，所述工程菌株由组成型启动子phema替换原始菌株的psrfa启动子得到；

4、其中，所述组成型启动子phema的核苷酸序列如seq id no.1所示；psrfa启动子部分序列的核苷酸序列如seq id no.18所示；

5、所述原始菌株选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌中的一种。

6、在本发明的一个实施方式中，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌td7(bacillussubtilis td7)。

7、本发明的第二个目的是提供一种上述组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株的构建方法，具体包括以下步骤：

8、(a1)将质粒pj-phema转化入原始菌株的感受态细胞中，得到重组菌株；

9、(a2)将步骤(a1)制备得到的重组菌株预处理后进行crispr/cas9基因编辑，将原始菌株的psrfa启动子替换为组成型启动子phema，得到组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株。

10、在本发明的一个实施方式中，步骤(a1)中，质粒pj-phema为质粒pjoe8999接入nsrfa、上游同源臂、phema启动子、下游同源臂得到的改造质粒。

11、在本发明的一个实施方式中，所述质粒pjoe8999的核苷酸序列如seq id no.14所示，nsrfa的核苷酸序列如seq id no.15所示、上游同源臂的核苷酸序列如seq id no.8所示、下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.9所示、phema启动子元件的核苷酸序列如seq idno.3所示。

12、在本发明的一个实施方式中，步骤(a2)中，所述预处理为将单克隆重组菌株转接于lb平板上。

13、在本发明的一个实施方式中，步骤(a2)中，crispr/cas9基因编辑为同源重组。

14、在本发明的一个实施方式中，同源重组过程中，温度为50～55℃，时间为12～16h。

15、在本发明的一个实施方式中，同源重组过程中，温度为50℃，时间为12h。

16、本发明的第三个目的是提供一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株的应用，所述工程菌株用于生产脂肽类表面活性素surfactin，具体包括以下步骤：

17、(b1)将工程菌株接种至发酵培养基中培养得到发酵液；

18、(b2)调节步骤(b1)得到的发酵液的ph低于2，后处理得到脂肽类表面活性素surfactin。

19、在本发明的一个实施方式中，步骤(b1)中，工程菌株的接种量为发酵培养基体积的1-5％。

20、在本发明的一个实施方式中，步骤(b1)中，所述发酵培养基包括50～80g/l蔗糖，15～30g/l硝酸钠，0.5～2g/l酵母粉，0.2～0.4g/l磷酸二氢钾，0.2～0.4g/l磷酸氢二钠，0.05～0.1g/l硫酸镁，5～8mg/l氯化钙，5～8mg/l一水合硫酸锰，5～8mg/l七水合硫酸亚铁(ph 7.0～7.2)。

21、在本发明的一个实施方式中，步骤(b2)中，所述后处理为利用萃取剂萃取发酵液后收集有机相烘干。

22、在本发明的一个实施方式中，所述萃取剂为乙酸乙酯。

23、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

24、本发明提供的组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株-枯草芽孢杆菌tdw4使用组成型启动子phema对psrfa启动子部分序列进行替换，明显提高了枯草芽孢杆菌的surfactin产量，并且相比于诱导型启动子，组成型启动子做表达时无需添加诱导剂，rp-hplc分析发酵液中脂肽产量从0.64g/l提升到了2.50g/l，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有潜在的工业应用价值。