HPV检测引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及hpv病毒检测，尤其涉及hpv检测引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、宫颈癌（cevical cancer，cc）是女性最常见的癌症之一，而人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，hpv）的持续感染是宫颈癌的主要危险因素之一。hpv是一种无包膜双链环状dna病毒，属于乳头瘤病毒科，有核心单拷贝的病毒基因组dna及病毒蛋白衣壳构成。目前发现的hpv约有200种型别，分为高危型和低危型，其中高危型hpv（high-risk hpv，hr-hpv）感染被认为是宫颈癌发病机制中最主要的因素。全世界传播的hr-hpv包括hpv16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82。

2、宫颈癌发病率和致死率较高，究其原因，是宫颈癌隐匿性较高，其通常在晚期才被发现，据统计全世界仍有近50%的患者诊断为局部晚期，但宫颈癌预防性筛查在发展中国家并未普及，造成宫颈癌发病率和致死率居高不下。who于2021年发布的宫颈癌筛查指南推荐hpv-dna检测作为宫颈癌筛查的首选筛查方法。因此，发展基于hpv-dna的宫颈癌快捷筛查方法，特别是针对hr-hpv的识别，将宫颈病变的高危人群筛查出来，有助于个性化早筛早诊，对于提示宫颈癌风险，从而降低宫颈癌发病率和致死率具有重要意义。

3、传统的hpv的检测手段，如细胞学检测和镜检，存在场所（专业实验室）和人员（专业检测人员）的限制，且检测所需时间较长，不利于hpv筛查的推广。

4、现有技术中针对hpv的检测主要使用荧光定量pcr技术，其依赖于特定荧光仪器和专业人员的操作，不利于检测的推广和便捷化。并且现有产品存在灵敏度和特异性不高的问题，如专利cn112575123a，其检测灵敏度约1.25e+05 copies/ml，也可能会受其他病原体的干扰，在实际中可能导致出现漏检或假阳性现象。因此，hpv病毒检测的准确程度还需改进；另外，中国专利cn114107560a公开了一种使用lamp技术进行hpv检测的引物组合及试剂盒，但其分别使用荧光法和染色体显色法进行检测，仍存在仪器要求高（荧光法）、在低浓度下判读困难及易出现假阴性（染色体显色法）的缺陷。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供hpv检测引物组，利用该引物组可对hpv进行检测，且灵敏度高；同时，本发明提供了含有该引物组的试剂盒，使用该试剂盒可实现对hpv的居家检测。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了hpv检测引物组，所述hpv检测引物组包括如下引物：

4、核苷酸序列如seq id no.1所示的引物hpv16 f3；

5、核苷酸序列如seq id no.2所示的引物hpv16 fip；

6、核苷酸序列如seq id no.3所示的引物hpv16 lf；

7、核苷酸序列如seq id no.4所示的引物hpv16 bip；

8、核苷酸序列如seq id no.5所示的引物hpv16 lb；

9、核苷酸序列如seq id no.6所示的引物hpv16 b3；

10、和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：

11、核苷酸序列如seq id no.7所示的引物hpv18 f3；

12、核苷酸序列如seq id no.8所示的引物hpv18 fip；

13、核苷酸序列如seq id no.9所示的引物hpv18 lf；

14、核苷酸序列如seq id no.10所示的引物hpv18 bip；

15、核苷酸序列如seq id no.11所示的引物hpv18 lb；

16、核苷酸序列如seq id no.12所示的引物hpv18 b3；

17、和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：

18、核苷酸序列如seq id no.13所示的引物hpv33 f3；

19、核苷酸序列如seq id no.14所示的引物hpv33 fip；

20、核苷酸序列如seq id no.15所示的引物hpv33 lf；

21、核苷酸序列如seq id no.16所示的引物hpv33 bip；

22、核苷酸序列如seq id no.17所示的引物hpv33 b3；

23、和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：

24、核苷酸序列如seq id no.18所示的引物hpv52 f3；

25、核苷酸序列如seq id no.19所示的引物hpv52 fip；

26、核苷酸序列如seq id no.20所示的引物hpv52 bip；

27、核苷酸序列如seq id no.21所示的引物hpv52 lb；

28、核苷酸序列如seq id no.22所示的引物hpv52 b3；

29、和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：

30、核苷酸序列如seq id no.23所示的引物hpv58 f3；

31、核苷酸序列如seq id no.24所示的引物hpv58 fip；

32、核苷酸序列如seq id no.25所示的引物hpv58 bip；

33、核苷酸序列如seq id no.26所示的引物hpv58 lb；

34、核苷酸序列如seq id no.27所示的引物hpv58 b3；

35、和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：

36、具有seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列经删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；

37、和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：

38、具有seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列经核苷酸取代或修饰，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；

39、和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：

40、与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列具有80%以上同源性或与与seq idno.1~27任意所示的核苷酸序列功能相似的衍生引物；

41、和/或，所述hpv检测引物组包括如下引物：

42、与seq id no.1~27任意所示的核苷酸序列互补的引物。

43、优选的，所述hpv16 bip引物的5’端标记有荧光基团；

44、所述hpv16 lf引物的5’端标记有生物素；

45、所述hpv18 fip引物的5’端标记有荧光基团；

46、所述hpv18 lf引物的5’端标记有生物素；

47、所述引物hpv33 lf的5’端标记有荧光基团；

48、所述引物hpv33 bip的5’端标记有生物素；

49、所述引物hpv52 bip的5’端标记有荧光基团；

50、所述引物hpv52 lb的5’端标记有生物素；

51、所述引物hpv58 bip的5’端标记有荧光基团；

52、所述引物hpv58 lb的5’端标记有生物素。

53、优选的，所述荧光基团为fam或fitc。

54、本发明还提供了上述hpv检测引物组在制备检测试剂盒中的应用。

55、优选的，所述hpv的分型包括hpv16、hpv18、hpv33、hpv52和hpv58中的一种或几种。

56、本发明还提供了一种检测hpv的试剂盒，包括上述hpv检测引物组和检测试剂。

57、优选的，所述试剂盒中引物hpv16 fip、引物hpv16 bip、引物hpv18 fip、引物hpv18 bip、引物hpv33 fip、引物hpv33 bip、引物hpv52 fip、引物hpv52 bip、引物hpv58fip或引物hpv58 bip的终浓度独立的为1.6~2.4μmol/l。

58、优选的，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dntp和bst dna聚合酶。

59、优选的，所述等温扩增缓冲液包括tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4和tween-20。

60、优选的，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫设置于底板上；所述判读区上设置检测线和质控线；

61、所述检测线中包被有fam抗体，fam抗体的浓度为0.05~0.15mg/ml；

62、所述质控线中包被有biotin-bsa溶液，所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5~3mg/ml。

63、本发明的技术效果和优点：

64、1、本发明组合灵敏度高，检测限低至500 copies/ml，有助于hpv16、hpv18、hpv33、hpv52、hpv58病毒感染的早筛早诊，便于及时进行干预治疗和控制病情；

65、2、本发明组合使用恒温扩增-核酸胶体金层析法，可在35min内完成检测反应，结果判断简便；

66、3、本发明组合使用恒温扩增-核酸胶体金层析法，仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，具有发展为居家自测的潜力，同时保持了检测的低成本化，有助于宫颈癌的早筛早诊。

67、4、lamp技术在配合相应的样本核酸释放剂时，可适用于居家自测，在降低检测费用的同时也有效提高了检测的便利性，对于hpv的早筛早诊、降低宫颈癌的发病率和致死率具有重要意义。