一种IL21-NKG2DCAR-T细胞及其制备方法和应用

本发明涉及肿瘤治疗的细胞药物领域，特别是涉及一种il21-nkg2d car-t细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤(mm)是一类致命的进行性血液系统恶性肿瘤，来源于产生抗体的浆细胞。mm是第二大血癌，占全球癌症相关死亡人数的2％。在过去的几十年里，mm的病理生理学和药物发现都取得了进展，然而对于晚期复发难治型肿瘤患者，目前治疗手段依然存在明显不足在。

2、近年来，一种新的肿瘤免疫疗法---嵌合抗原受体t细胞治疗(car-t)逐渐走入人们的视野，car-t疗法英文全称chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy，是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，并且一些临床前和临床试验结果显示，car-t疗法在对mm治疗中取得了令人鼓舞的治疗效果，但是这种特定的疾病依然还没有治愈的方法。

3、因此，寻找更有效的靶点从而增强car-t细胞治疗mm的疗效依然是现阶段迫在眉睫的事件。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种il21-nkg2d car-t细胞及其制备方法和应用，得到的il21-nkg2d car-t细胞可特异性靶向nkg2d配体蛋白高表达的多发性骨髓瘤(mm)细胞，可以在制备治疗mm的药物中进行应用。

2、本发明采用的技术方案为：

3、本发明提供了一种il21-nkg2d car-t细胞，所述il21-nkg2d car-t细胞在t细胞内表达il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白。

4、优选地，所述t细胞能够共表达细胞因子il21，并且其表面表达nkg2d分子，所述t细胞的胞内由4-1bb-cd3ζ分子传递t细胞活化信号。

5、优选地，所述il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白中il21、nkg2d-ect、cd8hinge、cd8tm、4-1bb、cd3ζ的氨基酸序列分别如seq id no：1～6所示。

6、优选地，il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：8所示。

7、优选地，所述t细胞来源于人外周血t淋巴细胞。

8、本发明还提供了一种il21-nkg2d car-t细胞的制备方法，包括：

9、(1)合成和扩增il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白基因，将所述il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；

10、(2)将慢病毒表达载体质粒和包装质粒共转染于hek293t细胞中，进行慢病毒包装和制备慢病毒；

11、(3)分离人外周血t细胞、培养扩增，并利用步骤(2)得到的慢病毒感染t细胞，使所述t细胞表达il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白，得到il21-nkg2d car-t细胞。

12、优选地，步骤(1)中，il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白的氨基酸序列如seqid no：8所示。

13、优选地，步骤(2)中，采用慢病毒表达载体质粒prrlsin和包装质粒pmd2.g/pcmvr8.74共转染。

14、优选地，步骤(3)中，将t细胞密度调整至500万/ml，然后按病毒：细胞＝1：5比例添加病毒。

15、本发明又提供了上述il21-nkg2d car-t细胞在制备治疗多发性骨髓瘤(mm)的药物中的应用。

16、本发明的有益效果是：

17、本发明采用嵌合抗原受体修饰和改造t细胞，将il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ分子在t细胞内表达，使改造后的t细胞能够特异性识别和杀伤mm细胞，得到的细胞具备更高效的抗mm活性。

技术特征：

1.一种il21-nkg2d car-t细胞，所述il21-nkg2d car-t细胞在t细胞内表达il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种il21-nkg2d car-t细胞，其特征在于，所述t细胞能够共表达细胞因子il21，并且其表面表达nkg2d分子，所述t细胞的胞内由4-1bb-cd3ζ分子传递t细胞活化信号。

3.根据权利要求1所述的一种il21-nkg2d car-t细胞，其特征在于，所述il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白中il21、nkg2d-ect、cd8 hinge、cd8 tm、4-1bb、cd3ζ的氨基酸序列分别如seq id no：1～6所示。

4.根据权利要求1所述的一种il21-nkg2d car-t细胞，其特征在于，

5.根据权利要求1所述的一种il21-nkg2d car-t细胞，其特征在于，所述t细胞来源于人外周血t淋巴细胞。

6.一种il21-nkg2d car-t细胞的制备方法，包括：

7.根据权利要求6所述的一种il21-nkg2d car-t细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，il21-nkg2d-cd8-4-1bb-cd3ζ融合蛋白的氨基酸序列如seq id no：8所示。

8.根据权利要求6所述的一种il21-nkg2d car-t细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用慢病毒表达载体质粒prrlsin和包装质粒pmd2.g/pcmvr8.74共转染。

9.根据权利要求6所述的一种il21-nkg2d car-t细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将t细胞密度调整至500万/ml，然后按病毒：细胞＝1：5比例添加病毒。

10.权利要求1～5任意一项所述的一种il21-nkg2d car-t细胞在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种IL21‑NKG2D CAR‑T细胞及其制备方法和应用，采用嵌合抗原受体修饰T细胞的改造方法，将IL21‑NKG2D‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ分子在T细胞内表达，该方法制备的CAR‑T细胞可特异性靶向NKG2D配体蛋白，并共表达细胞因子IL21。本发明的CAR‑T细胞对多发性骨髓瘤细胞具有良好的肿瘤杀伤作用。

技术研发人员：许新,韩昆昆,杨义力,梅啸,李瑞丽
受保护的技术使用者：苏州工业园区服务外包职业学院（苏州市服务外包人才培养实训中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15