鼠抗GDH杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用的制作方法

本发明属于抗体制备领域，尤其是涉及鼠抗gdh杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。

背景技术：

1、艰难梭菌（ clostridioides difficile）是一种专性厌氧的革兰染色阳性芽孢杆菌，1935年hall和o'toole首次从新生儿粪便中分离出该菌。1978年，bartlett等报道了艰难梭菌分泌的细胞毒素是引起抗生素相关腹泻、伪膜性肠炎的主要病因。近20年来，由于抗生素的普遍使用与老龄人口比例增加，艰难梭菌感染（clostridioides difficileinfection, cdi）的发病率、复发率和严重程度呈上升趋势。特别是近年来，随着艰难梭菌强毒力型菌株的出现，cdi的发病率显著增加，严重威胁公共卫生安全。

2、目前cdi已成为重要的医院感染之一，及早、正确的根据相关症状及检验结果诊断cdi，不仅有助于临床诊断和疾病预防，还可以指导合理使用抗生素以及减少不必要的医疗费用支出。2021年，由中华预防医学会制定的《艰难梭菌感染诊断（t/cpma 008-2020）》标准中提出临床样本的快速诊断方法，首先对样本中的谷氨酸脱氢酶（gdh）和毒素a/b同时进行检测，如果二者结果不一致，需结合pcr检测 tcdb基因，判断样本中有无产毒型艰难梭菌。谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase, gdh）是艰难梭菌的一种膜蛋白，稳定性好，且在各型艰难梭菌中具有高保守性，但该蛋白并不是产毒型艰难梭菌特有的，非产毒型菌株和梭菌属其他细菌也可产此酶，所以不能单独作为诊断方法，常作为初筛诊断性抗原。目前国内尚无获得医疗器械注册批件的艰难梭菌gdh检测试剂盒，而进口注册产品价格昂贵，有些还需要配合相应的仪器设备进行检测，因此亟需开发同类国产试剂盒替代进口产品，以便能在国内开展常规临床检测，及早监控疾病进展。

3、开发胶体金法的艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原及毒素检测试剂盒，首先需要分别获得谷氨酸脱氢酶抗原(gdh）及其毒素a和毒素b抗原，获得高纯度的抗原后，在小鼠体内激起良好的免疫反应后，采用杂交瘤技术，筛选高亲和力和特异性的抗体，用于相关体外诊断试剂的开发。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供鼠抗gdh杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。

2、本发明采用的技术方案是：鼠抗gdh杂交瘤细胞株，命名为1hf9，保藏编号为cgmccno.45517，或者命名为1ge10，保藏编号为cgmcc no.45516。

3、鼠抗gdh单克隆抗体，抗体1hf9包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如seq id no:1所示的cdrh1、seq id no:2所示的cdrh2和seq id no:3所示的cdrh3，轻链可变区包括如seq id no:4所示的cdrl1、seq id no:5所示的cdrl2和seq id no:6所示的cdrl3；

4、seq id no:1 cdrh1: gftfntnams

5、seq id no:2 cdrh2: rirsksdnhgtfyadsvkd

6、seq id no:3 cdrh3: swfgf

7、seq id no:4 cdrl1: sasssvssiyly

8、seq id no:5 cdrl2: rtshlas

9、seq id no:6 cdrl3: lqwssypyt

10、或者，

11、抗体1ge10包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如seq id no:11所示的cdrh1、seq id no:12所示的cdrh2和seq id no:13所示的cdrh3，轻链可变区包括如seqid no:14所示的cdrl1、seq id no:15所示的cdrl2和seq id no:16所示的cdrl3；

12、seq id no:11 cdrh1: gftfntnsms

13、seq id no:12 cdrh2: rirsrnnnfetyyadsvkd

14、seq id no:13 cdrh3：swfgy

15、seq id no:14 cdrl1: sasssvsssyly

16、seq id no:15 cdrl2: rtsnlas

17、seq id no:16 cdrl3: lqwnsypft

18、优选地，抗体1hf9重链可变区氨基酸序列为seq id no:7所示，轻链可变区氨基酸序列为seq id no:9所示；

19、seq id no:7

20、qvqlqqsggglvqpkgsltlsceasgftfntnamswvrqapgkglewiarirsksdnhgtfyadsvkdrltisrddlqnilylqmnnlktedtamyycvdswfgfwgqgtlvtvsa

21、seq id no:9

22、divltqspeimsaspgekvtltcsasssvssiylywyqqkpgsspklwiyrtshlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaasyfclqwssypytfgggtkleik

23、或者，

24、抗体1ge10重链可变区氨基酸序列为seq id no:17所示，轻链可变区氨基酸序列为seq id no:19所示；

25、seq id no:17

26、evqlqesggglvqpkgslklscaasgftfntnsmswvrqapgkglewvarirsrnnnfetyyadsvkdrftisrddsqsmlylqmnnlksedtamyycvdswfgywgqgtlvtvsa

27、seqid no:19

28、divltqspaimsaspgekvtltcsasssvsssylywyqqkpgsspklwiyrtsnlasgvparfsgsgsgtsysltissmeaedaasyfclqwnsypftfgggtkleik

29、优选地，抗体1hf9由保藏编号为cgmcc no.45517的鼠抗gdh杂交瘤细胞株产生；

30、抗体1ge10由保藏编号为cgmcc no.45516的鼠抗gdh杂交瘤细胞株产生。

31、核酸分子，包含编码鼠抗gdh单克隆抗体的核苷酸。

32、优选地，核酸分子编码抗体1hf9的重链可变区的核苷酸序列如seq id no:8所示，核酸分子编码抗体1hf9的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:10所示；

33、seq id no:8

34、caggtgcagcttcagcagtctggtggaggattggtacagcctaaagggtcattgacactctcatgtgaagcctctggattcaccttcaataccaatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaagggtttggaatggattgctcgcataagaagtaaaagtgataatcatggaacattttatgccgattcagtgaaagacaggttaaccatctccagagatgatttacaaaacatactctatctgcaaatgaacaacttgaaaactgaggacacagccatgtattactgtgtggactcctggtttggtttctggggccaagggactctggtcactgtctccgca

35、seq id no:10

36、gacattgtgctcacccagtctccagaaatcatgtctgcatctcctggggagaaggtcactttgacctgcagtgccagttcaagtgtaagttccatctacttgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggatttataggacatcccacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgcctcttatttctgccttcagtggagtagttatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa

37、或者，

38、核酸分子编码抗体1ge10的重链可变区的核苷酸序列如seq id no:18所示，核酸分子编码抗体1ge10的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:20所示；

39、seq id no:18

40、gaggtgcagctgcaggaatctggtggaggattggtgcagcctaaagggtcattgaaactctcatgtgcagcctctggattcaccttcaataccaattccatgagctgggtccgccaggctccaggaaagggtttggaatgggttgctcgcataagaagtagaaataataattttgaaacatattatgccgattcagtgaaagacagattcaccatctccagagatgattcacaaagcatgctctatctgcaaatgaataatttgaaaagtgaggacacagccatgtattactgtgtggactcctggtttggttactggggccaagggactctggtcaccgtctctgca

41、seq id no:20

42、gacattgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctcctggggagaaggtcaccttgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttccagctacttgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccaaactctggatttataggacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgcctcttatttctgccttcagtggaatagttacccgttcacgttcgggggggggaccaagctggaaataaaa

43、鼠抗gdh单克隆抗体在制备检测谷氨酸脱氢酶抗原试剂中的应用。

44、优选地，将鼠抗gdh单克隆抗体用于体外诊断试剂盒，具体用于胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、荧光免疫试剂盒或者微流体芯片。

45、一种检测谷氨酸脱氢酶抗原的试剂盒，含有鼠抗gdh单克隆抗体。

46、优选地，包括双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，抗体1hf9为包被抗体，抗体1ge10为金标抗体；

47、或者抗体1ge10为包被抗体，抗体1hf9为金标抗体。

48、本发明具有的优点和积极效果是：提供了鼠抗gdh杂交瘤细胞株和单克隆抗体，抗谷氨酸脱氢酶单克隆抗体在各方面均有较佳表现，效价达到了1:1280000以上，从而适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒。