ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用

本发明属于生物，具体涉及ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。

背景技术：

1、丝状真菌在真菌界中占据重要地位，广泛应用于工业、农业、医药以及基础生物学研究领域。一些重要的工业菌株用于生产酶、有机酸等物质，如黑曲霉、藤仓赤霉等。由于丝状真菌基因组相对简单、可操作性强，因此也常用于真核生物的一些生物学特性研究。基因工程技术是菌种改造和研究的有效方法。在基因工程操作过程中，筛选标记是筛选和获得正确改造菌株的一个重要手段，此类筛选标记主要包括抗生素抗性标记和营养缺陷标记。其中，营养缺陷标记筛选用到单一必需营养成分缺失的培养基，相对抗生素抗性标记在使用过程中需要用到抗生素筛选，筛选条件更加温和。同时，无论何种筛选标记，在基因工程操作时常常会碰到筛选标记缺乏的现象，尤其在需要对基因组多个位点进行突变的情况下。

2、通常，在一些模式菌种中，如酿酒酵母，由于科研关注度较高，通常会有较多的筛选标记可供选择。而在一些关注度较少的菌种中，如很多非模式丝状真菌中，上述的筛选标记十分缺乏。这些菌种往往伴随较高的抗生素耐受性，如球孢白僵菌，导致可用的抗生素筛选标记变得十分有限；而很多丝状真菌，至今没有可供使用的营养缺陷筛选标记，如藤仓赤霉菌。在丝状真菌中进行基因工程改造时，亟需强选择性、有效的筛选标签对改造后的菌株进行筛选。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中丝状真菌在基因工程操作过程中缺乏营养缺陷筛选标记的问题，本发明提供了ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。ppt1基因，即磷酸泛乙烯基转移酶编码基因，与真菌的赖氨酸代谢途径、聚酮类和非核糖体肽类物质等的翻译后修饰相关。实验证明，在丝状真菌中敲除了ppt1基因后，菌株呈现出赖氨酸营养缺陷型，赖氨酸作为必需氨基酸，菌株在含有赖氨酸的培养基上生长，反之则不生长。

2、本发明采用的技术方案是：ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。sfp型磷酸泛乙烯基转移酶(pptase)可以对acp结构域进行4’-磷酸泛乙烯基转移的翻译后修饰，即磷酸泛酰巯基乙胺基化。编码该酶的ppt1基因广泛存在于一些丝状真菌中，对多种初级代谢和次级代谢合成起着较为重要的调控作用，如对氨基酸合成酶、聚酮合酶、非核糖体多肽合酶的蛋白修饰，将辅酶a上的磷酸泛酰巯基乙胺基转移到上述蛋白的保守丝氨酸残基上，由此合成脂肪酸、聚酮、非核糖体肽。

3、具体地，所述ppt1基因作为丝状真菌的筛选标记。在丝状真菌基因组改造中，以缺失ppt1基因的菌株为出发菌株进行后期基因编辑操作，所述的营养缺陷型筛选标记ppt1基因可以作为一种有效的筛选标签。

4、具体地，所述营养缺陷包括赖氨酸营养缺陷。针对因ppt1功能缺失导致的赖氨酸营养缺陷菌株，以ppt1基因为筛选标记在丝状真菌中进行基因工程改造。例如利用缺失了ppt1基因的菌株作为出发菌株，以赖氨酸营养缺陷为筛选标记，在丝状真菌基因进行基因工程改造时，对目的基因进行敲除并利用ppt1基因供体片段进行替换，通过在不含赖氨酸的培养基上进行生长筛选，获得成功转化并携带有ppt1基因的改造菌株。

5、具体地，所述筛选标记包括ppt1基因的完整表达序列，所述完整表达序列包括启动子、ppt1基因的开放阅读框、终止子。

6、具体地，所述丝状真菌包括禾谷镰刀菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌。丝状真菌作为重要的模式生物，具有较短的世代时间、易于培养和遗传操作的特点，被广泛用于研究生物学基本过程。所述的ppt1基因在禾谷镰刀菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌等真菌中广泛存在，上述真菌已知可以引起植物赤霉病害。

7、具体地，所述应用的方法为：以敲除ppt1基因的基因工程菌为出发菌，以赖氨酸营养缺陷作为筛选标记，利用crispr/cas9技术敲除目的基因并替换成ppt1基因，筛选得到在不含l-赖氨酸的培养基中正常生长的转化子。

8、进一步地，所述基因工程菌通过以下方法制备得到：将pcas-ppt1载体和供体片段导入藤仓赤霉菌，利用crispr/cas9技术对藤仓赤霉菌ppt1基因进行敲除，经菌落pcr验证筛选，得到基因工程菌。

9、进一步地，所述供体片段包括藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游同源臂、抗性筛选基因。

10、优选地，所述藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游同源臂的长度分别为500～520bp。

11、优选地，所述抗性筛选基因为潮霉素抗性基因hygr。

12、优选地，通过pcr获得藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游500bp左右的同源臂，以及潮霉素抗性基因hygr，并对其进行融合pcr获得供体片段。

13、进一步地，所述pcas-ppt1载体包括藤仓赤霉菌ppt1基因的grna、cas9蛋白表达框。

14、优选地，所述藤仓赤霉菌ppt1基因的grna包括20bp的pam序列。

15、优选地，所述藤仓赤霉菌ppt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。本发明所涉及的丝状真菌为藤仓赤霉菌，藤仓赤霉菌的sfp型ppt1基因序列为seq id no.1所示。

16、本发明还提供了一种以ppt1基因作为筛选标记的丝状真菌的基因改造方法，所述方法包括：以敲除ppt1基因的基因工程菌为出发菌，以赖氨酸营养缺陷作为筛选标记，利用crispr/cas9技术敲除目的基因并替换成ppt1基因，筛选得到在不含l-赖氨酸的培养基中正常生长的转化子。

17、本发明的有益效果：本发明提供了一种有效的营养缺陷型筛选标签，在丝状真菌中进行基因组改造时以ppt1基因作为赖氨酸营养缺陷型标签进行筛选。相对抗生素抗性标记的筛选过程，营养缺陷标记筛选条件更加温和。同时，在基因工程操作时常常会碰到筛选标记缺乏的现象，尤其在需要对基因组多个位点进行突变的情况下。因此，以ppt1基因为营养缺陷型筛选标签在丝状真菌中进行基因改造，可以起到良好的筛选作用，为丝状真菌基因工程后期的阳性筛选提供了一种新的途径。

技术特征：

1.ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ppt1基因作为丝状真菌的筛选标记。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述营养缺陷包括赖氨酸营养缺陷。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述丝状真菌包括禾谷镰刀菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：以敲除ppt1基因的基因工程菌为出发菌，以赖氨酸营养缺陷作为筛选标记，利用crispr/cas9技术敲除目的基因，并替换成ppt1基因，筛选得到在不含l-赖氨酸的培养基中正常生长的转化子。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌通过以下方法制备得到：将pcas-ppt1载体和供体片段导入藤仓赤霉菌，利用crispr/cas9技术对藤仓赤霉菌ppt1基因进行敲除，经菌落pcr验证筛选，得到基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述供体片段包括藤仓赤霉菌ppt1基因的上下游同源臂、抗性筛选基因。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述pcas-ppt1载体包括藤仓赤霉菌ppt1基因的grna、cas9蛋白表达框。

9.根据权利要求6～8任一所述的应用，其特征在于，所述藤仓赤霉菌ppt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

10.一种以ppt1基因作为筛选标记的丝状真菌的基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：以敲除ppt1基因的基因工程菌为出发菌，以赖氨酸营养缺陷作为筛选标记，利用crispr/cas9技术敲除目的基因并替换成ppt1基因，筛选得到在不含l-赖氨酸的培养基中正常生长的转化子。

技术总结
本发明提供了ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用。实验证明，在丝状真菌中敲除了ppt1基因后，菌株呈现出赖氨酸营养缺陷型，赖氨酸作为必需氨基酸，菌株在含有赖氨酸的培养基上生长，反之则不生长。以ppt1基因为营养缺陷型筛选标签在丝状真菌中进行基因改造，可以起到良好的筛选作用，且相对抗生素抗性标记的筛选过程，营养缺陷标记筛选条件更加温和，为丝状真菌基因工程后期的阳性筛选提供了一种新的途径。

技术研发人员：柳志强,张佳梦,岑宇科,李明涵,王远山,薛亚平,郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16