一种RNA保存液及其用途的制作方法

本发明属于医学生物检测领域，具体涉及一种rna保存液及其用途。

背景技术：

1、核糖核苷酸（ rna) ，普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，是遗传信息的载体。尽管高质量的 rna 可通过立即从新鲜外周血或其他组织样本中抽提得到，但在实际检查中，外周血样本多不具备立即抽提的条件。因此，如何保存样本从而获得高质量的 rna 至关重要。目前常用的rna 抽提前血样保存的方法主要有低温冻存、pax-gene全血rna管保存、样本中添加rna保存液。

2、低温冻存是目前较为普遍的一种血样处理方法 ，使 用 乙 二 胺 四 乙 酸（ethylenediamine tetraacetic acid，edta）抗凝管采集并储存外周血，过程简便、无须额外处理且可避免外源性因素的影响，但外周血中rna 容易受内源性因素，如大量存在的核糖核酸酶（ribonuclease，rnase）的影响，在收集和储存过程中rna易发生降解。

3、使用 paxgene全血rna管保存能够显著提高从血样中分离出的rna 质量，但paxgene全血rna管过于昂贵，样本的收集成本过高。

4、样本采集后如果无法立即进行提取，可以保存在rna保存液中，rna保存液中主要成分是蛋白变性剂，通过抑制rnase的活性防止rna降解。但现有的保存液效果不稳定，当样本需要运输，反复冻融，保存时间较长，温度的变化可能会影响样本中rna的检测。

技术实现思路

1、为了克服上述缺陷，提供一种低成本，并能在不同保存时长、不同温度变化时保持样本中rna稳定的rna保存液，具体的，

2、本发明第一方面，提供一种rna保存液，所述保存液包括蛋白变性剂、螯合剂、还原剂和ph缓冲液，所述保存液的ph为3.5-5.0，所述蛋白变性剂用于抑制ｒna 酶活性，所述蛋白变性剂包括异硫氰酸胍和氯化锂（licl）。

3、优选的，所述ph为3.8-5.0，可以是上述范围的任一值，例如4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8。

4、优选的，所述异硫氰酸胍：licl的摩尔质量比为1：（1-2），具体比例可以是1:1.5。

5、更进一步优选的，所述蛋白变性剂还包括氧钒核糖核苷复合物。

6、优选的，所述蛋白变性剂的终浓度为1-10m。可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如1.0、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.3、6.6、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0m。

7、更优选的，所述蛋白变性剂包括1.5-3.0m的异硫氰酸胍和1.5-6.0m的licl。进一步优选的，所述蛋白变性剂包括1.5-3.0m的异硫氰酸胍、1.5-6.0m的licl和5-20mm的氧钒核糖核苷复合物。

8、在一个具体的实施方式中，所述蛋白变性剂包括2m的异硫氰酸胍和3m的licl。

9、在一个具体的实施方式中，所述蛋白变性剂包括2m的异硫氰酸胍、3m的licl和10mm的氧钒核糖核苷复合物。

10、优选的，所述螯合剂包括edta、乙二胺四乙酸二钾和/或乙二胺四乙酸三钾。更优选的，所述螯合剂包括edta。

11、优选的，所述螯合剂的终浓度为0.3-2.0mm，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mm。

12、更优选的，所述螯合剂包括终浓度为0.7-1.5mm的edta，进一步优选的，所述螯合剂包括终浓度为1.0mm的edta。

13、优选的，所述还原剂包括三（2－羧乙基）膦、β－巯基乙醇和二硫苏糖醇中的一种或多种。

14、更优选的，所述还原剂包括β－巯基乙醇。

15、优选的，所述还原剂的终浓度为质量百分比0.5%-3%，更优选的，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0%。

16、进一步优选的，所述还原剂包括0.5%-2%的β－巯基乙醇，优选为0.8%-1.5%。

17、在一个具体的实施方式中，所述还原剂包括1%的β－巯基乙醇。

18、优选的，所述rna保存液还包括表面活性剂。

19、更优选的，所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂中的一种或多种，例如tween20、sds、triton x-100、十二烷基硫酸锂等等。

20、优选的，所述表面活性剂的终浓度为质量百分比0.2%-5.0%，更优选的，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0%。

21、优选的，所述rna保存液还包括盐离子，例如硫酸铵、焦磷酸钠等等。

22、更优选的，所述盐离子的终浓度为5-30mm，例如，2.5-15mm硫酸铵和2.5-15mm的焦磷酸钠。可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如2.5、3.0、3.5、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.3、6.6、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0mm。

23、优选的，所述rna保存液还包括甘氨酸，所述甘氨酸终浓度为30-70mm，可以是上述范围的任一值，或者任一范围，例如30、35、40、45、50、55、60、65、70mm。

24、优选的，所述rna保存液的ph缓冲液包括浓盐酸、tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液和hepes等，维持保存液的ph为3.5-5.0。

25、在一个具体的实施方式中，所述rna保存液包括2m异硫氰酸胍，3m licl，1mmedta，10mm 硫酸铵，1%tween20，10mm 焦磷酸钠，1% β－巯基乙醇，50mm 甘氨酸，缓冲液为浓盐酸，ph为4.8。或者，

26、所述rna保存液包括2m异硫氰酸胍，3m licl，1mm edta，10mm 氧钒核糖核苷复合物，10mm 硫酸铵，1%tween20，10mm 焦磷酸钠，1% β－巯基乙醇，50mm 甘氨酸，缓冲液为浓盐酸，ph为4.8。

27、上述百分浓度为质量百分比。

28、本发明第二方面，提供一种上述rna保存液的制备方法，所述制备方法包括将rna保存液的各种组分混合配置，其中用ph缓冲液调节ph，过滤获得rna保存液。

29、rna保存液的各种组分如上所定义。

30、本发明第三方面，提供一种包含rna的样本的保存方法，所述保存方法包括利用上述任一的rna保存液对样本进行保存。

31、优选的，所述样本来源于任一的样本，包括但不仅限于组织、细胞、体液、空气、土壤和/或物体表面等等。更优选的，所述体液来自唾液、血液、血清、组织液、尿液、精液、羊水、脊髓液、结膜液、阴道液、粪便或汗液等等。

32、进一步优选的，所述样本来自咽拭子采集样本、痰液样本、肺泡灌洗液样本、外周血样本、血浆样本、血清样本、淋巴结样本、胃肠组织样本、粪便样本或尿液样本等等。

33、优选的，所述的保存方法并不属于疾病的诊断和/或治疗方法。

34、本发明的有益效果：

35、1、采用本发明的rna保存液可适用于不同的保存温度，例如4℃，室温，37℃，可以避免反复冻融导致的rna损伤，有利于温度条件变化时的储存以及长途转运。

36、2、采用本发明的rna保存液能稳定的保证样本中的rna总量，保存时间长，至少可以达到7天，即便是在37℃下，保存7天后，扩增ct值依然与4℃即时检测的ct值相同。本保存液具有良好的稳定性。