一种丁酰化低聚半乳糖及其制备和应用

本发明涉及食品领域，具体地，涉及一种多酯化度丁酰化低聚半乳糖的制备和应用，以及不同酯化度的丁酰化低聚半乳糖的分离纯化。

背景技术：

1、炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，ibds)近年来在发展中国家的高速发展，已成为全球性疾病。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,uc)和克罗恩病(crohndisease,cd)是ibds的主要亚型，其中uc是一种慢性、影响结肠的特发性炎症性疾病，其特征是从直肠开始并延伸到结肠近端的复发性和缓解性粘膜炎症。目前的治疗方法是通过口服5-氨基水杨酸等炎症因子抑制剂来缓解肠道炎症，但其副作用往往很大。肠道微生物群与宿主免疫反应之间相互作用的失调被认为是ibds发病的原因。一方面，由肠上皮细胞组成的肠道屏障与由iga、粘液和抗菌蛋白组成的肠粘液层可抵御病原体。另一方面，微生物组衍生的代谢物或具有杀微生物或微生物抑制特性的小分子可以抵抗病原微生物的定植。例如，脆弱拟杆菌合成的多糖a可抑制白细胞介素il-17的产生，并促进cd4t细胞产生il-10，从而预防肝螺杆菌引起的结肠炎。因此，肠道菌群稳态有助于预防和减轻ibds过程。

2、因此亟待开发一种新的辅助缓解策略，特别是应用于ibd早期阶段，建立一种有效的营养干预策略来通过改变微生物群落结构和增强机体免疫活性缓解疾病症状。使目标补充剂在肠道的特定位置发挥其生物活性，且不造成身体的其他负担。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有炎症性肠病治疗的不足，提供一种多酯化度丁酰化低聚半乳糖制备和应用，以及三种酯化度的丁酰化低聚半乳糖的分离制备。

2、本发明的第一个目的是提供一种多酯化度丁酰化低聚半乳糖的制备方法。

3、本发明的第二个目的是提供一种所述的制备方法制备得到的多酯化度丁酰化低聚半乳糖。

4、本发明的第三个目的是提供一种从多酯化度丁酰化低聚半乳糖中分离出三种酯化度的丁酰化低聚半乳糖的方法。

5、本发明的第四个目的是提供一种所述的方法分离得到的产物。

6、本发明的第五个目的是提供一种多酯化度丁酰化低聚半乳糖和/或上述分离方法得到的产物在改善肠道菌群和/或促进益生菌生长方面的应用。

7、本发明的第六个目的是提供一种多酯化度丁酰化低聚半乳糖在制备治疗和/或缓解炎症性肠病的药物中的应用。

8、本发明的第七个目的是提供一种治疗和/或缓解炎症性肠病的药物。

9、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

10、本发明以低聚半乳糖(gos)作为载体，将正丁酸乙烯酯或正丁酸与gos结合形成酯键，制备得到多酯化度丁酰化低聚半乳糖(b-gos)。利用柱层析法将所得到的b-gos依据不同的酯化度分离得到三种不同酯化程度的组分，分别是：单酯丁酰化低聚半乳糖(m b-gos)、双酯丁酰化低聚半乳糖(d b-gos)、聚酯丁酰化低聚半乳糖(p b-gos)。对制备和分离得到的丁酰化低聚半乳糖进行鉴定以及探究其体外发酵特性和益生活性，并研究其对葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的炎症性肠病小鼠的改善作用。

11、因此，本发明要求保护以下内容：

12、一种多酯化度丁酰化低聚半乳糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

13、s1.将低聚半乳糖溶液与正丁酸乙烯酯或低聚半乳糖溶液与正丁酸在脂肪酶的催化下充分反应，然后纯化，得到反应粗产物；

14、s2.将s1所得的反应粗产物充分溶解于1～5％的甲醇水溶液(v/v)中得到反应液，将反应液加入c18层析柱中，使用1～5％的甲醇水溶液(v/v)进行洗脱，除掉杂质；

15、s3.用无水甲醇洗脱s2中所得的洗脱产物，收集洗脱液；除去洗脱液中的有机溶剂，进行冷冻干燥，即得。

16、优选地，步骤s1为将低聚半乳糖溶液与正丁酸乙烯酯在脂肪酶的催化下充分反应，然后纯化，得到反应粗产物。

17、优选地，所述低聚半乳糖溶液的溶剂为无水吡啶、二甲基亚砜或n，n-二甲基甲酰胺。

18、更优选地，所述脂肪酶为脂肪酶435或固定化脂肪酶tlim。

19、最优选地，所述脂肪酶为固定化脂肪酶tlim。

20、更优选地，反应条件为50～60℃环境下反应40～50h。

21、最优选地，反应条件为55℃环境下反应48h。

22、更优选地，步骤s1中，所述纯化为去除多余的脂肪酶和大部分的溶剂。

23、更优选地，所述去除多余脂肪酶的方法为将圆底烧瓶内样品进行抽滤。

24、更优选地，步骤s2中，使用2％的甲醇水溶液(v/v)作为流动相。

25、更优选地，当洗脱液在265nm紫外灯下不显色时，说明杂质除尽。

26、一种上述的制备方法制备得到的多酯化度丁酰化低聚半乳糖。

27、一种从多酯化度丁酰化低聚半乳糖中分离出不同酯化度的丁酰化低聚半乳糖的方法，将上述的多酯化度丁酰化低聚半乳糖的水溶液进行c18柱层析色谱分离，依次按照10～15％的甲醇水溶液(v/v)、30～35％的甲醇水溶液(v/v)、50～55％的甲醇水溶液(v/v)进行洗脱，收集合并相同洗脱液，得到3个洗脱液，分别纯化，冻干后分别得到单酯丁酰化低聚半乳糖(m b-gos)、双酯丁酰化低聚半乳糖(d b-gos)、聚酯丁酰化低聚半乳糖(p b-gos)产物。

28、一种上述的方法分离得到的产物。

29、优选地，10～15％的甲醇水溶液(v/v)分离产物为单酯丁酰化低聚半乳糖，30～35％的甲醇水溶液(v/v)分离产物为双酯丁酰化低聚半乳糖，50～55％的甲醇水溶液(v/v)分离产物为聚酯丁酰化低聚半乳糖。

30、更优选地，15％的甲醇水溶液(v/v)分离产物为单酯丁酰化低聚半乳糖，35％的甲醇水溶液(v/v)分离产物为双酯丁酰化低聚半乳糖，55％的甲醇水溶液(v/v)分离产物为聚酯丁酰化低聚半乳糖。

31、一种上述的多酯化度丁酰化低聚半乳糖和/或上述的产物在改善肠道菌群和/或促进益生菌生长方面的应用。

32、优选地，所述改善肠道菌群包括抑制proteobacteria和/或escherichia-shigella的生长。

33、优选地，所述促进益生菌生长包括促进bacteroides、bifidobacterium、faecalibacterium、fusobacterium和/或agathobacter中的一种或几种的生长。

34、一种上述的多酯化度丁酰化低聚半乳糖在制备治疗和/或缓解炎症性肠病的药物中的应用。

35、优选地，所述治疗和/或缓解炎症性肠病包括减轻炎症性肠病引起的体重下降、便血、粪便粘稠、结肠变短、水肿、出血、肠道组织损伤和/或炎症浸润等中的一种或几种症状和/或同时恢复肠道屏障功能。

36、一种上述的多酯化度丁酰化低聚半乳糖在缓解体重下降、便血、粪便粘稠、结肠变短、水肿、出血、肠道组织损伤和炎症浸润等中的一种或几种症状和/或同时恢复肠道屏障功能中的应用。

37、一种治疗和/或缓解炎症性肠病的药物，所述药物含有上述的多酯化度丁酰化低聚半乳糖。

38、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

39、本发明利用酶促合成法将正丁酸乙烯酯或正丁酸与低聚半乳糖结合形成酯键制备得到多酯化度丁酰化低聚半乳糖，同时分离得到三种酯化度的丁酰化低聚半乳糖。所述多酯化度丁酰化低聚半乳糖和三种酯化度的丁酰化低聚半乳糖均能够被肠道菌群很好的降解和利用，同时产生丁酸，不仅可以促进肠道菌群的丰富度和多样性，改善肠道菌群，还可以促进益生菌的生长、抑制有害菌的生长。所述多酯化度丁酰化低聚半乳糖能显著改善小鼠的炎症性肠病，缓解炎症性肠病症状。本发明的丁酰化低聚半乳糖可以使低聚半乳糖与丁酸在肠道的特定位置发挥生物活性，不造成身体的其他负担。