一种基于数字微流控芯片的单细胞双组学共建库方法

本发明属于数字微流控，具体涉及一种基于数字微流控芯片的单细胞双组学共建库方法。

背景技术：

1、单细胞测序技术允许对来自不同细胞类型和状态的单细胞进行基因组、表观基因组、转录组或蛋白组分析，从而在单细胞分辨率下研究和剖析感兴趣的生理过程。然而，仅从单个细胞中抽取一种类型的分子只能提供不完整的信息，因为一个细胞的状态是由其全部组学中的分子的复杂相互作用决定的，整个细胞所蕴含的信息从来不是局限在某一个组学中，而是在各个组学之间流动。单组学测序方法虽发展迅猛，但面临着无法展示细胞复杂的基因调控网络的全貌的问题，例如基因组学的测序方法只能获得单核苷酸变异、拷贝数变异等信息，无法得知某个基因的转录情况。因此，需要发展多组学联合分析技术来同时检测不同类型的分子，以调查更多的细胞状态，完整地认识细胞。

2、dna甲基化是哺乳动物基因组上最重要的修饰，5mc也被称为“第五碱基”，通常发生在cg二核苷酸处。dna甲基化作为表观遗传标记之一活跃在众多生理过程中，例如dnmt缺失的小鼠表现出严重的发育异常最终早期胚胎死亡，以及几乎所有癌症都以甲基化水平失调为特征。转录组作为“中转站”将细胞基因型和表型联系起来，转录活动会根据细胞的特性和对环境刺激的反应而发生巨大的变化。同时研究单细胞甲基化组和转录组，可以在获得基因组上甲基化修饰的状态和基因表达情况的同时，将二者有机地联系起来，从而剖析dna甲基化修饰介导的基因调控网络。现有的单细胞甲基化组和转录组联合分析方法主要包括以下几种：scm&t-seq通过流式细胞术分选单细胞，利用oligo-dt磁珠富集裂解细胞释放出的mrna，磁分离含有dna的上清液和捕获mrna的磁珠，再对二者分别建库测序。scmt-seq手动挑选出完整的单细胞，通过控制条件裂解细胞膜但不损伤细胞核膜，从而释放出细胞质中的mrna并保持细胞核中的基因组完整，接着挑取细胞核分离核质，分别对dna和mrna建库测序。sctrio-seq手动挑选单细胞后，裂解细胞并离心，rna相较dna更轻于是离心后位于上清液，因此吸取上层溶液用于转录组建库测序，下层溶液进行甲基化建库测序。这三种均使用物理方法对dna和rna进行分离，存在不可避免的信息丢失的情况。通过选择性裂解细胞膜而不损害细胞核膜，再分离核质会损失掉细胞核中的mrna；而裂解整个细胞，不论是利用修饰oligo-dt的磁珠特异性捕获mrna，还是根据密度差离心使dna沉降，都会造成样品损失。此外，以上方法单细胞捕获困难，并且甲基化组和转录组的建库方法不同，每个单细胞需要制备两种测序文库，也会导致操作复杂，付出额外的成本。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于数字微流控芯片的单细胞双组学共建库方法。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种基于数字微流控芯片的单细胞双组学共建库方法，

4、该数字微流控芯片采用lift-off工艺制成，具有至少一单细胞分离反应单元，该单细胞分离反应单元具有一第一储液区、第二储液区和一混合反应区域，

5、第一储液区具有第一储液电极，

6、第二储液区具有第二储液电极，

7、混合反应区设有多个混合反应电极和一用于捕获单细胞且直径为190-210μm的亲水位点，

8、第一储液区和通过若干第一输送电极连通混合反应区，第二储液区和通过若干第二输送电极连通混合反应区，通过第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合而形成的纳升级液滴的体积小于通过第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合而形成的纳升级液滴的体积；

9、具体包括如下步骤：

10、(1)将细胞悬液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞悬液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞悬液液滴转移至上述亲水位点，使细胞悬液液滴中仅有一个细胞正对下方亲水部，断电静置使该细胞在重力的作用下自然沉降至亲水位点，此时拖走整个细胞悬液液滴，亲水位点将留有含单个细胞的液滴；

11、(2)清除第一储液区内的液体，将细胞裂解液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生裂解液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该裂解液液滴转移至上述亲水位点，室温孵育进行细胞裂解；

12、(3)清除第一储液区内的液体，将逆转录预混液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生逆转录液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该逆转录液滴转移至上述亲水位点，与上述裂解液液滴混合，进行逆转录反应；

13、(4)将cdna扩增预混液置于第二储液区内，通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合，产生cdna扩增液滴，接着通过该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该cdna扩增液滴转移至上述亲水位点，与其上的液体混合，进行cdna扩增反应；

14、(5)清除第一储液区内的液体，将蛋白消化液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生蛋白消化液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该蛋白消化液转移至上述亲水位点，与其上的液体混合，进行蛋白消化反应；

15、(6)清除第一储液区内的液体，将λ-dna工作液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生λ-dna工作液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该λ-dna工作液滴转移至上述亲水位点，与其上的液体混合，进行λ-dna掺入；

16、(7)在步骤(6)所得的物料中加入亚硫酸氢盐转化试剂进行亚硫酸氢盐转化反应，接着进行dna的柱纯化和脱磺化，然后进行线性扩增和文库构建。

17、在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞裂解液的配方如下表所示：

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19、在本发明的一个优选实施方案中，所述逆转录预混液的配方如下表所示：

20、

21、

22、进一步优选的，所述逆转录反应的程序如下表所示：

23、

24、在本发明的一个优选实施方案中，所述cdna扩增预混液的配方如下表所示：

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26、进一步优选的，所述cdna扩增反应的程序如下表所示：

27、

28、

29、在本发明的一个优选实施方案中，所述蛋白消化液的配方如下表所示：

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31、在本发明的一个优选实施方案中，所述λ-dna工作液的配方如下表所示：

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33、在本发明的一个优选实施方案中，所述亚硫酸盐转化反应的程序如下表所示：

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35、在本发明的一个优选实施方案中，所述通过第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合而形成的纳升级液滴的体积为85.88nl，所述通过第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合而形成的纳升级液滴的体积为154.12nl。

36、本发明的有益效果是：

37、1、本发明基于数字微流控技术，具有试剂消耗量小、低损失、无污染和低成本的优点，亲水位点结构赋予其高效快速捕获单个细胞的能力。对比离心管中微升级的反应体积，数字微流控芯片中极小的纳升级的反应体积可以大大提升核酸分子的有效反应浓度，所得文库的比对率、文库复杂度和cpg位点覆盖度全面高于离心管平台。同时还可以有效降低试剂的消耗量，试剂成本降低了近62倍。

38、2、本发明无需预先分离dna和rna，直接构建甲基化组和转录组二合一的测序文库，这不仅简化了实验操作流程，更避免物理分离过程中的信息损失。通过后续的数据分析过程，准确无误地根据甲基化水平将测序reads识别并分配为dna或rna。

39、3、本发明在保持准确性的同时具有优越的测序性能，双组学转录组与单组学基因表达相关性良好，双组学甲基化组拥有比单组学更高的文库复杂度，以单碱基分辨率在染色体层面观察到胞嘧啶甲基化状态的特征。

40、4、本发明将dna甲基化和基因表达有机地联系在一起，非常适合于受精卵或循环肿瘤细胞等稀有细胞，分析胚胎发育或肿瘤发生发展过程中的甲基化修饰对于基因表达的调控机制，展现出广泛的生物学研究应用的潜力。