一种靶向脑膜炎败血伊丽莎白菌的结合转移型的基因编辑系统及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种靶向脑膜炎败血伊丽莎白菌的结合转移型的基因编辑系统及其应用。

背景技术：

1、病原菌耐药性正在威胁全球公共卫生安全和世界可持续发展目标，是人类当前面临的重大科学难题之一。新冠病毒合并耐药病原菌的双重感染，加大了整个临床医治的难度。伊丽莎白菌(elizabethkingia spp.)是人类临床的新兴病原菌，是院内侵入性感染的重要病原体。临床分离株主要是脑膜炎败血伊丽莎白菌(e.meningosepticum)和按蚊伊丽莎白菌(e.anophelis)，两种菌基因组同源性极高，临床表现一致，均可引起肺部感染和新生儿脑膜炎等疾病，且致死率较高，故临床上统称为伊丽莎白菌感染，其中，脑膜炎败血伊丽莎白菌的系列图谱如图1所示。近年来，伊丽莎白菌导致的感染病例呈上升趋势，在全球范围散发，加之该菌对β－内酰胺类、氨基糖苷类和四环素类等抗菌药物的高耐药率，将给临床治疗带来极大挑战。在我国伊丽莎白菌主要分布在icu和老年病房，临床分离率也在升高，且缺乏有效的监控措施，具有爆发流行的风险。因此对该新发病原菌的研究十分必要，尤其是挖掘针对其有效的抗感染药物靶点。

2、目前，关于伊丽莎白菌的研究主要集中在流行病调查统计阶段，对于其感染的分子机制还了解甚少。针对该新兴的病原菌分子机制的研究，尚缺乏有效的遗传操作系统，如何敲除致病性基因，消除耐药基因一直限制该病原菌的研究。因此，采用新型的结合型同源交换质粒系统无痕敲除系统以及dap营养缺陷型大肠杆菌x7213菌株直接靶向敲除多重耐药菌的耐药基因以及毒力基因，有利于更好的控制多重耐药病原菌的流行传播，以及挖掘有效的抗菌靶标。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于涉及提供一种靶向脑膜炎败血伊丽莎白菌的结合转移型的基因编辑系统及其应用。

2、本发明具体采用以下技术方案实现：

3、本发明第一方面提供了一种可水平转移的基因敲除载体pre112，该载体包含酶切位点smai和kpni。

4、(1)在原有载体的基础上于2980bp-3780bp处插入构建一段ermf序列。

5、顶部链：5’-atgacaaaaaagaaattgcc-3’

6、底部链：5’-ctacgaaggatgaaattttt-3’

7、(2)于2793bp-2979bp处插入构建一段启动子promoter_ermf序列：

8、顶部链：5’-tttaccactttccagtctta-3’

9、底部链：5’-tagtaacttcttacaggtga-3’

10、从而在同源重组载体导入脑膜炎败血伊丽莎白菌后，使得菌株获得红霉素抗性。

11、(3)在510bp-620bp处构建插入一段pompa序列：

12、顶部链：5’-gccacatttggtgttttttt-3’

13、底部链：5’-acttaatttttttaattaca-3’

14、本发明第二方面提供了一种含有敲除靶向耐药基因的可水平转移的基因敲除重组载体，该重组载体由敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段与所述载体pre112重组构建得到。

15、进一步，所述敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段通过以下步骤得到：

16、(1)选择靶向耐药基因；

17、(2)选取靶向耐药基因上下游各1000bp长度的序列，上游为up，下游为down；

18、(3)分别设计up、down的引物

19、up-forward：此引物为up片段的正向引物，同时在5’端带有与pre112载体的smai酶切位点顶部链的同源片段；

20、up-reverse：此引物为up片段的反向引物，同时在5’端带有与down片段底部链3’端的同源片段；

21、down-forward：此引物为down片段的正向引物，同时在5’端带有与up片段顶部链3’端的同源片段；

22、down-reverse：此引物为down片段的反向引物，同时在5’端带有与pre112载体的kpni酶切位点底部链的同源片段；

23、(4)以脑膜炎败血伊丽莎白菌为模板，进行pcr反应，扩增up、down基因片段；

24、反应体系：50μl

25、 2×prime star max 25μl 引物-forward 1μl 引物-reverse 1μl 脑膜炎败血伊丽莎白菌 1μl <![cdata[ddh₂o]]> 22μl

26、(5)180v，20min对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目的片段up和down所在条带进行切胶回收；

27、(6)以上述回收的up、down片段作为模板，up-forward、down-reverse为引物，进行融合pcr；

28、反应体系：50μl

29、 2×prime star max 25μl up-forward 1μl down-reverse 1μl up 1μl down 1μl <![cdata[ddh₂o]]> 22μl

30、(7)180v，20min对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，对up+down同源重组连接片段所在条带进行切胶回收，获得敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段。

31、进一步，所述敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段与所述载体pre112重组构建，具体包括以下步骤：

32、(1)载体的构建：酶切

33、

34、37℃，水浴1小时，后进行180v，20min琼脂糖凝胶电泳，对酶切产物进行切胶回收，获得pre112载体。

35、(2)酶连反应

36、 2×multif seamless assembly mix 10μl pre112载体 ≥30ng up+down同源重组片段 m片段：m载体＝10:1 <![cdata[ddh₂o]]> upto 20μl

37、50℃，12分钟。

38、本发明第三方面提供了上述含有敲除靶向耐药基因的可水平转移的基因敲除重组载体敲除靶向耐药基因的方法，其包括以下步骤：

39、1)取酶联反应的重组载体吸取10μl转化入大肠杆菌x7213感受态细胞，转化完成后，将菌体混匀后涂布加入dap营养液与氯霉素的lb固体培养基中，筛选得到单克隆菌落；

40、2)将上述转化后的单菌落，与脑膜炎败血伊丽莎白菌进行接合转移，涂布于含有氯霉素、红霉素的两种抗生素抗性的培养基平板中；

41、3)挑取双抗平板中的单菌落，进行pcr验证；

42、4)将验证后的菌落进行传代培养，三次后，涂布于6％的蔗糖培养基中；

43、5)挑取单菌落，进行pcr验证，确认是否成功敲除靶向耐药基因。

44、6)将验证后的单菌落进行菌种保藏。

45、本发明第四方面提供了上述可水平转移的基因敲除载体pre112以及上述重组载体在敲除脑膜炎败血伊丽莎白菌靶向耐药基因中的应用。

46、本发明提供的耐药基因及其敲除载体pre112，是可以有效消减耐药基因以及携带耐药基因的多重耐药质粒。同时，利用本发明提供的敲除载体pre112制备方法较易得到靶向抗生素耐药基因的敲除载体，也为脑膜炎败血伊丽莎白菌其他耐药基因的敲除及削减研究提供了有效方法和基础。