一种糖基转移酶、重组表达载体、制备方法及其在合成人参皂苷Rh2中的应用

本发明涉及生物制药，具体涉及一种糖基转移酶、重组表达载体、制备方法及其在合成人参皂苷rh2中的应用。

背景技术：

1、人参中含有丰富的人参皂苷，具有广泛的药理活性和良好的新药开发前景。根据其苷元骨架结构，人参皂苷可分为三个亚类：达玛烷型、奥克梯隆型和齐墩果烷型。达玛烷型是最常见的人参皂苷，可进一步分为原人参二醇(ppd)型和原人参三醇(ppt)型。一些人参皂苷是通过消化后，在肠道微生物的作用产生的。人参皂苷rh2和ck是一种部分去糖基化的原人参二醇，通过iκbα的磷酸化和降解参与调节炎症，而人参皂苷rg1和rb1具有抗衰老活性。人参皂苷rg3和rh2具有抗肿瘤活性，人参皂苷re具有抗氧化和心脏保护作用。然而天然产物特殊的化学结构使其稳定性、水溶性不高，进而导致生物利用率较低，实际的人体利用效果并不显著。

2、人参皂苷rh2(3β-o-glc-protopanaxadiol)是红参中一种微量但有特色的药理成分，表现出多种药理活性，如抗肿瘤作用、改善心脏功能和纤维化、抗炎作用、抗生素作用和良好的药用潜力。但由于人参中人参皂苷rh2的含量极低，且提取方法较为复杂，从植物中直接提取，其生产成本较高，产量不稳定。又因rh2的结构复杂且具有多个活性基团，化学合成要进行多次的保护和去保护这些活性基团，使得其合成成本高，且要用到大量有机试剂，对后期分离纯化成本增加负担，也很进行工业化生产。目前已有报道构建细胞工厂来生产人参皂苷rh2，但由于udp糖基转移酶的较差性能和人参皂苷对宿主细胞的细胞毒性，人参皂苷rh2的生物合成仍然是不利的。细胞工程合成rh2还在实验阶段，产量低，细胞环境复杂，产物复杂，增加后续的分类纯化成本。而酶法合成rh2，体外催化条件简单可控，反应体系内的物质相对单一简单，便于产物后期分离纯化，最有可能实现rh2的大规模工业化制备。

3、人参皂苷rh2的制备方法主要包括化学方法和生物方法，主要是通过其他原人参二醇类皂苷水解葡萄糖或由原人参二醇和葡萄糖缩合而成。如：1)酸水解法：西洋参在盐酸条件下，70℃水浴降解1h得到人参皂苷rh2(r构型)；2)碱水解法：ppd型人参皂苷在naoh溶液中100℃水解6h得到人参皂苷rh2(s构型)；3)微生物转化法：人参皂苷rb1在40℃下，被双胞柱孢菌转化为人参皂苷rh2；4)酶转化法：α-阿拉伯糖苷酶能将人参皂苷rg3在55℃水解24h转化成为人参皂苷rh2。大多采用化学法制备得到人参皂苷rh2，其反应过程较难控制，反应要求较高、副产物多、污染环境等缺点。与化学法合成相比，酶法合成的反应条件更加温和，不会改变其化学结构，且对底物特异性选择，无污染等优点，能够避免化学法合成带来的危害，但酶法合成也存在一些不足，酶易失活影响合成效率。

4、为了解决酶反应自身有许多限制，引入固定化技术。固定化酶(immobilizedenzyme)是一种利用适当的物理和化学方法，将纯化后的酶溶液固定在于一定空间的产品，使其既保持自身特性，又能不断反应、循环利用的产品。由于固定化酶易于回收，能够快速终止酶的反应和重复酶的使用，从而降低测定成本。此外，固定化酶的储存稳定性、ph和耐热性得到改善，提高生产水平，节省了人力。随着纳米科学的繁荣激发了人们对取决于颗粒大小的特性产生了浓厚的兴趣。例如，由于超顺磁性的出现，磁性纳米颗粒在10-20nm的典型尺寸范围内表现出最大的性能。这些纳米颗粒表现出巨大的比表面积、大的表面积比、在外部磁场下易于分离和高质量转移，是催化系统中载体的完美特性。磁性fe3o4壳聚糖载体用于l-天冬酰胺酶固定化显示出更好的催化效率和热稳定性；yang等制备一种具有核-壳结构的浅孔微球载体固定化菊粉酶保留了初始73％的活性。

5、在酶固定化中，酶在表面的吸附能力取决于纳米粒子和蛋白质表面的化学键的激活情况。由于具有更大的饱和磁化强度和磁化率，磁铁矿是固定生物分子/蛋白质的最广泛的磁性载体。由于裸露的铁磁性纳米颗粒往往表现出高反应性，在一定的环境下容易降解，导致分散性和稳定性较差。天然产物特殊的化学结构使其稳定性、水溶性不高，进而导致生物利用率较低，实际的人体利用效果并不显著。其中人参皂苷rh2含量稀少，又因其结构复杂难以大量合成，产量受限问题已成为限制三萜皂苷rh2广泛应用的关键因素，现如今人参皂苷rh2的制备大多采用化学法制备得到，其反应过程较难控制，反应条件较高、副产物多、污染环境等缺点。

技术实现思路

1、为获取一种高效合成人参皂苷rh2的方法，本发明提供了一种糖基转移酶、重组表达载体、制备方法及其在合成人参皂苷rh2中的应用，本发明利用糖基转移酶ge02773，并在酶纯化过程中采用了新型的酶一步纯化固定化技术，高效的合成了人参皂苷rh2。

2、本发明提供了一种糖基转移酶，所述糖基转移酶是来源于枯草芽孢杆菌sl-44的ge02773基因编码的糖基转移酶，命名为ge02773蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列如seq idno.1所示，该蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明还提供了一种糖基转移酶的制备方法，所述糖基转移酶由ge02773基因异源表达所得。

4、进一步地，包括如下步骤：

5、s1，糖基转移酶基因目的片段的获得：以枯草芽孢杆菌sl-44基因组dna为模板，用核苷酸序列如seq id no.3所示的引物ge02773f和核苷酸序列如seq id no.4所示的引物pcr扩增，获得糖基转移酶基因目的片段；

6、s2，重组表达载体构建：将糖基转移酶基因目的片段克隆到pucm-t载体上，转化到大肠杆菌，进行pcr扩增，获得的扩增产物与pet-28a(+)质粒连接，转化大肠杆菌，获得重组表达载体。

7、本发明还提供了一种由糖基转移酶构建得到的重组表达载体。

8、本发明还提供了一种由所述的重组表达载体制备得到的糖基转移酶粗酶液，糖基转移酶粗酶液制备过程为：重组表达载体转化至大肠杆菌，培养至od600等于0.8，iptg诱导后超声破碎后收集上清即为糖基转移酶粗酶液。

9、本发明还提供了一种所述的糖基转移酶、重组表达载体或糖基转移酶粗酶液在合成人参皂苷rh2中的应用。

10、进一步地，人参皂苷rh2由ppd转化获得。

11、进一步地，fe3o4/pmg/nta-ni2+磁性微球固定化糖基转移酶能提高合成人参皂苷rh2的效率。

12、进一步地，所述fe3o4/pmg/nta-ni2+磁性微球的制备过程为：mps对fe3o4改性获得fe3o4/mps核壳微球，将fe3o4/mps核壳微球分散在乙腈中进行超声反应后加入gma、mba和aibn的混合物以引发聚合，蒸馏乙腈后磁分离获得fe3o4/pmg微球；

13、次氮基三乙酸和naoh溶解于去离子水中混匀，然后加入fe3o4/pmg微球，75-80℃下剧烈搅拌6 -7h，磁铁分离获得fe3o4/pmg/nta微球；

14、fe3o4/pmg/nta微球与nicl2溶液混合反应，获得fe3o4/pmg/nta-ni2+磁性微球。

15、进一步地，所述一步纯化固定化过程为：fe3o4/pmg/nta-ni2+磁性微球分散在pbs缓冲液中，然后加入糖基转移酶粗酶液孵育后获得固定化酶液；

16、将固定化酶液、ppd和udpg混合后于35-37℃下催化4-4.5h，用正丁醇进行萃取，取上层清液冻干，获得人参皂苷rh2。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

18、1、本发明对人参皂苷rh2生物催化合成的关键酶进行挖掘，并从枯草芽孢杆菌sl-44基因组中的序列片段进行筛选，结果与糖基转移酶家族序列在结构上具有极大的相似性，筛选潜在的可能催化原人参二醇糖基化合成稀有皂苷rh2的功能基因，并通过fe3o4/pmg/nta-ni2+一步纯化固定化糖基转移酶，以原人参二醇为底物酶法转化合成人参皂苷rh2，从而提高rh2的产量，因此需要获得可催化原人参二醇合成稀有人参皂苷rh2的糖基转移酶基因，为合成人参皂苷rh2的有效途径。

19、2、本发明以酶法合成稀有人参皂苷rh2为目的，发现并筛选获得合成rh2所需的新的糖基转移酶ge02773，并在酶纯化过程中采用了新型的酶一步纯化固定化技术，更有效的合成人参皂苷rh2。

20、3、本发明通过将fe3o4磁性纳米粒子改性后与ni2+复合制备磁性fe3o4/pmg/nta-ni2+微球，该复合微球具有更高的磁化率和良好的his标记蛋白结合能力，微球可以循环多次，而不会显著丧失与酶的结合能力。既实现了酶的一步纯化固定化，又可以将酶快速分离，是比较实用的固定化材料。