一种烟雾病脑血管内皮模型的构建方法

本发明属于生物，具体涉及一种构建烟雾病脑血管内皮模型的方法。

背景技术：

1、烟雾病是一种慢性脑血管疾病，是导致我国儿童和青少年脑卒中常见的病因。其特征是颈内动脉及其主要分支进行性闭塞或狭窄，在颅底形成异常的烟雾血管网络。烟雾病的病理表现为内膜纤维细胞增厚，弹性层不规则起伏，中膜变薄，以及细胞外基质异常沉积。由于发病部位位于颅内，难以获取临床标本，目前也尚未有动物模型模拟出疾病的表型，严重缺乏阻碍了该疾病的研究进展。迫切需要探索烟雾病模型和新的治疗策略。

2、环指蛋白213(rnf213)基因被鉴定为烟雾病的易感基因，rnf213p.r4810k(rs112735431)突变携带者烟雾病发病风险显著增高。目前的研究主要在斑马鱼和小鼠中进行，采用基因编辑技术将rnf213敲入、敲除或敲低，检测不同组织rnf213表达和观察相关动物的血管形态。虽然取得一定进展，但均未能揭示rnf213突变导致或参与烟雾病发病的关键机制。体外实验，有学者将诱导多能干细胞(ipscs)分化为普通的内皮细胞、检测内皮细胞形态和功能，也未有显著的进展。而烟雾病的主要发病在颅内，提出一种脑微循环内皮细胞模型来模拟烟雾病，作为烟雾病的机制研究和治疗研究是现阶段亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种烟雾病脑血管内皮模型的构建方法，该方法构建的模型脑微循环内皮细胞血脑屏障功能受损、成管能力减弱，成为烟雾病疾病的新模型。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供一种烟雾病脑血管内皮模型的构建方法，包括如下步骤：(1)用accutase细胞消化液孵育ipscs；(2)在人胚胎干细胞培养基中添加rho相关蛋白激酶抑制剂，将ipscs涂覆在涂层板上，扩增培养；(3)对扩增后的ipscs进行分化，先用第一阶段培养基培养ipscs，12-36h后，将第一阶段培养基更换为第二阶段培养基，培养4～7天后，将第二阶段培养基更换为第三阶段培养基，培养1～3天后，分离细胞，转移至第四阶段培养基，长期维持培养，即得烟雾病脑血管内皮模型。本发明所述第一阶段培养基含有dmem/ham'sf12培养基、chir99021、mem非必需氨基酸溶液、glutamax添加剂和β-巯基乙醇；所述第二阶段培养基含有dmem/ham's f12培养基、mem非必需氨基酸溶液、glutamax添加剂、β-巯基乙醇和b-27添加剂；所述第三阶段培养基含有人内皮无血清培养基、成纤维细胞生长因子(bfgf)、维甲酸(ra)和b-27添加剂；所述第四阶段培养基为人内皮无血清培养基和b-27添加剂。

4、优选的，所述rho相关蛋白激酶抑制剂的浓度为8～12mm。

5、优选的，所述涂层板含有matrigel基质胶、玻连蛋白、synthemax ii微载体中的一种。

6、优选的，所述扩增培养的时间为2～4天。

7、优选的，在第二阶段培养基培养细胞时，需每天更换培养基。

8、本发明提供所述的构建方法制备的烟雾病脑血管内皮模型。

9、本发明提供所述的烟雾病脑血管内皮模型在烟雾病机制和治疗研究中的应用。

10、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

11、本发明首次提出将烟雾病患者的诱导多能干细胞(ipscs)分化为脑微循环内皮细胞，构建烟雾病脑血管内皮模型，可以更好的模拟疾病，为烟雾病的机制研究和治疗提供新的思路。

技术特征：

1.一种烟雾病脑血管内皮模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述rho相关蛋白激酶抑制剂的浓度为8～12mm。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述涂层板含有matrigel基质胶、玻连蛋白、synthemax ii微载体中的一种。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述扩增培养的时间为2～4天。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在第二阶段培养基培养细胞时，需每天更换培养基。

6.如权利要求1～5任意一项所述的构建方法制备的烟雾病脑血管内皮模型。

7.权利要求6所述的烟雾病脑血管内皮模型在烟雾病机制和治疗研究中的应用。

8.权利要求6所述的烟雾病脑血管内皮模型在筛选治疗烟雾病药物中的应用。

技术总结
本发明提供一种烟雾病脑血管内皮模型的构建方法，属于生物技术领域。本发明先将iPSCs用Accutase细胞消化液处理，然后涂覆在涂层板上，在含有Rho相关蛋白激酶抑制剂的人胚胎干细胞培养基中扩增培养；然后转移至第一阶段培养基培养分化，12‑36h后，将第一阶段培养基更换为第二阶段培养基，培养4～7天后，将第二阶段培养基更换为第三阶段培养基，培养1～3天后，分离细胞，转移至第四阶段培养基，长期维持培养，即得烟雾病脑血管内皮模型。经试验验证该烟雾病脑血管内皮模型中脑微循环内皮细胞血脑屏障功能受损、成管能力减弱，成为烟雾病疾病的新模型，为烟雾病的机制研究和治疗提供新的思路。

技术研发人员：张谦,薛艺萌,赵继宗
受保护的技术使用者：首都医科大学附属北京天坛医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16