一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法

本发明涉及海洋活性物质制备的，尤其涉及一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法。

背景技术：

1、军曹鱼，又称海鲡，是一种暖水性大型鱼类和重要的养殖海鱼，在全球范围分布较广，在西太平洋、大西洋和印度洋的热带、亚热带和暖温带水域均发现其存在。在我国，军曹鱼集中分布在南海和台湾海域，广东省和海南省是军曹鱼养殖大省。事实上，与其它养殖鱼类相比，军曹鱼具有环境适应性强和抗病能力强特点。此外，其生长速率极快，一年养的军曹鱼体重可高达4-8kg，雌性军曹鱼的生长速度和体型更是几乎为雄性的两倍。随着人工选育和深海网箱养殖技术不断发展，以及营养基因组学和功能饲料在军曹鱼喂养中的应用，军曹鱼已成为最有前景的深海网箱养殖鱼类之一。

2、鱼类在加工过程中，会产生大量的副产物(如鱼头、内脏和鱼骨等)，它们通常会被视为废弃物处理，这将导致严重的浪费和环境污染问题。有研究表明这些副产物可能是较好的海洋鱼油来源。前期研究发现，军曹鱼属高脂鱼类，且其内脏中脂质含量高达鱼湿重的30％。众所周知，鱼油中富含dha和epa。已有大量研究证明了dha在预防和治疗冠心病、高脂血症、动脉粥状硬化、炎症、抑郁症和阿尔兹海默症中扮演着重要的角色。因此，它们被广泛应用于功能性食品、保健品和药品中。事实上，高纯度的dha和epa鱼油浓缩物比鱼油本身更受青睐，因为它们允许总脂的每日摄入量保持在尽可能低的水平，因此，对原料鱼油中dha和epa进行富集纯化是研究其生理功能的基础。目前，市售的dha和epa鱼油产品以游离型、乙酯型和甘油三酯型为主。然而，有研究发现，磷脂型dha和epa(dha/epa-pl)较甘油三酯型、游离型和乙酯型dha和epa具有更高的生物利用度，这可能与磷脂的双亲性结构和特殊的极性头部基团相关。

3、鱼类是dha/epa-pl的主要来源，但是直接从鱼类中获取高纯度的dha/epa-pl需要经过多级纯化处理，难度较大、耗费较高且得率极低。因此，高纯度磷脂型dha/epa的制备成为了研究者们关注的话题。酶法制备dha/epa-pl是最常用的方法，其可以利用不同特异性的酶来选择性的进行水解和酯化反应。然而，目前市场上的结构磷脂，通常是以陆地植物基原料磷脂来制备的，其中，大豆磷脂是最常用的磷脂原料，然而大豆磷脂中本身不存在dha和epa，因此制备得到的dha/epa-pl中，dha和epa的浓度较低。例如中国专利申请cn108265090a中公开了以大豆磷脂作为原料制备含有磷脂型dha和磷脂型epa的油脂组合物的方法，但是磷脂型dha和磷脂型epa的含量分别为所述油脂组合物c的9.0-15.0wt％和18.0-25.0wt％，含量并不高。

技术实现思路

1、本发明为解决上述问题，提供一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法。

2、本发明第一目的在于提供一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，具体包括如下步骤：

3、s1、处理军曹鱼鱼肝：清洗军曹鱼的鱼肝，吸干水分，将鱼肝均浆；

4、s2、鱼肝油总脂的提取：取均浆后的鱼肝，加入所述鱼肝质量分数为0.05～0.15‰的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，加入体积比为1:1～3的二氯甲烷甲醇混合溶液，水浴振荡0.5～1.5h，过滤、分离滤液和滤渣，收集滤液；再向所述滤渣中加入二氯甲烷，水浴振荡0.5～1.5h，过滤、收集滤液；合并两次滤液，加入质量分数为0.7～1％的氯化钾溶液，混匀，静置0.5～1.5h，收集下层液体，旋转蒸发蒸干溶剂，得到鱼肝油总脂；

5、s3、湿法填层析硅胶柱；将所述鱼肝油总脂溶于二氯甲烷中上样，依次洗脱中性脂、糖脂、磷脂；收集磷脂洗脱液，旋蒸除去溶剂，得到高纯度磷脂组合物；

6、s4、将高纯度磷脂组合物中加入固定化磷脂酶a1进行催化酸解反应，制备富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物。

7、优选的，步骤s4包括如下子步骤：

8、s41、按重量份数称取1份所述高纯度磷脂组合物和4～10份游离脂肪酸作为底物，加少量水，振荡混匀；加入所述底物质量分数15～35％的固定化磷脂酶a1，充入氮气，在45～60℃、转速为150～200r/min的恒温水浴下反应15～48h；

9、s42、反应结束后，立即抽滤，收集滤液，在35～45℃下旋蒸除去溶剂，得到粗产品；

10、s43、用4℃预冷的丙酮对所述粗产品进行脱油处理，直至上清液滴于无尘玻璃片挥发干后无油迹，离心、收集沉淀层，氮气吹干后即得到富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物。

11、优选的，步骤s41中游离脂肪酸的制备方法如下：将步骤s3得到的中性脂进行皂化、酸化处理，制备得到游离型脂肪酸。

12、优选的，步骤s41中高纯度磷脂组合物和游离脂肪酸的重量比为1:5。

13、优选的，步骤s41中固定化磷脂酶a1的添加量为所述底物质量分数的20％。

14、优选的，步骤s41中恒温水浴的反应温度为50～55℃、时间为24～36h。

15、优选的，步骤s3中的中性脂用含1％乙酸的二氯甲烷洗脱，所述的糖脂用体积比为9:1的丙酮甲醇混合溶液洗脱，所述的磷脂用甲醇洗脱。

16、优选的，步骤s2中的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚添加量为所述鱼肝质量分数的0.1‰；所述二氯甲烷甲醇混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:2。

17、优选的，步骤s42中还包括，用正己烷冲洗反应的容器和固定化磷脂酶a1，收集冲洗液，与所述滤液合并，以提高提取率。

18、本发明第二目的在于提供一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法制备的富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物，所述磷脂组合物中epa和dha的含量之和大于50％。

19、与现有技术相比，本发明能够取得如下有益效果：

20、(1)以被视为废弃物的低价值军曹鱼肝脏为原料，原料成本低廉、易得；减少了鱼副产物资源浪费和污染问题，促进了鱼副产物的高值化利用；

21、(2)以柱层析法分离纯化得到的磷脂为原料磷脂，以实验室自制的dha/epa-ffa(将柱层析得到的中性脂进行皂化，酸化制备游离型脂肪酸，然后利用尿素包合法和酶法催化法进行二次富集得到)为酰基供体，以固定化磷脂酶a1为催化剂，来制备高纯度dha/epa-pl；

22、(3)操作简单，获得的产物磷脂中dha和epa含量之和可以占磷脂的50％以上，比粗体产品的含量提高一倍。

技术特征：

1.一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤s4包括如下子步骤：

3.根据权利要求2所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤s41中游离脂肪酸的制备方法如下：将步骤s3得到的中性脂进行皂化、酸化处理，制备得到游离型脂肪酸。

4.根据权利要求3所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤s41中高纯度磷脂组合物和游离脂肪酸的重量比为1:5。

5.根据权利要求4所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤s41中固定化磷脂酶a1的添加量为所述底物质量分数的20％。

6.根据权利要求5所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤s41中恒温水浴的反应温度为50～55℃、时间为24～36h。

7.根据权利要求3-6任意一项所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中的中性脂用含1％乙酸的二氯甲烷洗脱，所述的糖脂用体积比为9:1的丙酮甲醇混合溶液洗脱，所述的磷脂用甲醇洗脱。

8.根据权利要求7所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚添加量为所述鱼肝质量分数的0.1‰；所述二氯甲烷甲醇混合溶液中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:2。

9.根据权利要求8所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤s42中还包括，用正己烷冲洗反应的容器和固定化磷脂酶a1，收集冲洗液，与所述滤液合并，以提高提取率。

10.权利要求1所述的一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法制备的富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物，其特征在于：所述磷脂组合物中epa和dha的含量之和大于50％。

技术总结
本发明涉及海洋活性物质制备的技术领域，尤其涉及一种富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物的制备方法。包括：清洗军曹鱼鱼肝，吸干水分，均浆；加入少量抗氧化剂、二氯甲烷甲醇混合溶液，水浴振荡，过滤、分离滤液和滤渣，收集滤液；向滤渣中加入二氯甲烷，水浴振荡，过滤、收集滤液；合并两次滤液，加入氯化钾溶液，混匀，静置0.5～1.5h，收集下层液体，蒸干溶剂，得到鱼肝油总脂；湿法填层析硅胶柱；将鱼肝油总脂溶于二氯甲烷中上样，依次洗脱中性脂、糖脂、磷脂；收集磷脂洗脱液，旋蒸除去溶剂；加入固定化磷脂酶A<subgt;1</subgt;进行催化酸解反应，制备富含多不饱和脂肪酸的磷脂组合物。优点在于：操作简单，成本低廉，产品中DHA和EPA含量高。

技术研发人员：曹君,崔景涛,李川
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16