检测侵袭性真菌的组合物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物，特别地，涉及检测侵袭性真菌的组合物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、据报道，器官移植和恶性肿瘤患者中真菌感染的患病率高达20％～40％，且往往是致命性感染，侵袭性真菌病(invasivefungaldisease，ifd)即侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection，ifi)，占医院获得性感染的8％～15％，病死率高。

2、镰刀菌(fusarium)是一种罕见的病原真菌，可导致严重的侵袭性镰刀菌感染。随着免疫受损患者的增加，侵袭性镰刀菌感染的发生率也比过去几年有所增加。在白血病患者、实体器官移植受者和异体骨髓移植等高危人群间，镰刀菌是第二大常见病原菌，仅次于曲霉菌。临床显示由侵袭性镰刀菌感染的病死率高达79％-81％。

3、组织胞浆菌病是由荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)引起的肺部和血液感染性疾病，肺组织胞浆菌病根据病人病原体数量、病程的长短和宿主的免疫状态可分为急性、慢性肺组织胞浆菌病和播散性组织胞浆菌病等类型。组织胞浆菌病对于免疫功能正常的患者常常不治而愈，而对于人类免疫缺陷病毒(hiv)感染或者有其他免疫功能低下患者则可致病，严重者病原体向全身单核巨噬细胞系统播散，引起肺外的全身疾病，称为播散性组织胞浆菌病，致死率高。

4、毛霉目真菌(mucorales)在自然界中广泛存在，可通过人体吸入、摄入或外伤后接触引发机会性感染，导致毛霉病(mucormycosis)的发生。近年来毛霉病的发病率快速跃升，临床上，毛霉目真菌更倾向于感染免疫缺陷人群、糖尿病患者或有外伤的人群，主要致病菌为根霉属、横梗霉属和毛霉属。毛霉常侵袭血管壁和血管腔，引起炎症和血栓形成，局部血管损伤后可引起出血，导致组织坏死。

5、隐球菌(crytococcus neoformans)在自然界广泛分布，家鸽、家禽的粪便易受污染，主要侵犯中枢神经系统和肺部。隐球菌为条件致病菌，在传统意义上主要存在于艾滋病、恶性肿瘤、器官移植等免疫功能低下患者中，最易感染中枢神经系统，其次是皮肤与肺，但近年来免疫功能正常的人群中隐球菌感染的病例逐渐增多，并且发现肺隐球菌感染的发病率也在逐年升高。肺隐球菌病患者的临床表现无特异性，多表现为咳嗽、咳痰、发热、胸闷、胸痛，少数伴有痰中带血、夜间盗汗、乏力，胸部影像学又表现为多样性，容易误诊为肺结核、肿瘤、肺炎等其他疾病。

6、镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌和隐球菌等侵袭性真菌侵袭能力强、治疗时间长、预后差、死亡率高。目前实验室常规的检测手段如染色镜检、真菌培养等，耗时长，操作复杂，且需专业人士才能准确判断结果。因此，临床对能够简便快速地检测侵袭性真菌的分子诊断试剂有较大需求，这对于实现其早期诊断和治疗至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测侵袭性真菌的组合物、试剂盒及其应用，以实现对侵袭性真菌高灵敏、特异性的检测。

2、根据本发明的一个方面，提供一种检测侵袭性真菌的组合物，包括如seq id no:1～3所示的检测镰刀菌的上下游引物及探针，和/或，如seq id no:4～6所示的检测荚膜组织胞浆菌的上下游引物及探针，和/或，如seq id no:7～9所示的检测毛霉目真菌的上下游引物及探针，和/或，如seq id no:10～12所示的检测隐球菌的上下游引物及探针中的至少一种。本发明提供的检测侵袭性真菌的组合物能够实现对镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌的检测和区分，且特异性高，灵敏度高，这对于侵袭性真菌的快速诊断具有重要意义，在侵袭性真菌的检测领域有良好的应用前景。

3、优选地，包括如seq id no:1～3所示的检测镰刀菌的上下游引物及探针、如seqid no:4～6所示的检测荚膜组织胞浆菌的上下游引物及探针、如seq id no:7～9所示的检测毛霉目真菌的上下游引物及探针和seq id no:10～12所示的检测隐球菌的上下游引物及探针。本发明通过对上下游引物及对应探针的精心设计，能够同时对镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌进行检测，使不同的侵袭性真菌能够得到针对性的治疗。而且上述检测侵袭性真菌的组合物特异性高，灵敏度高，从而在同时检测和区分镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌时达到较高的准确度和灵敏度。

4、优选地，在检测侵袭性真菌的组合物中，各成分以混合的形式存在。本发明提供的组合物能够在单管反应体系中同时对镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌进行检测，且特异性高，灵敏度高，各侵袭性真菌对应的上下游引物和对应的探针之间相互影响小，抗干扰性强。

5、优选地，检测侵袭性真菌的探针上连接有荧光报告基因。

6、优选地，检测镰刀菌的探针的荧光报告基因为fam，检测荚膜组织胞浆菌的探针的荧光报告基团为hxe，检测毛霉目真菌的探针的荧光报告基团为rox；检测隐球菌的探针的荧光报告基因为cy5。

7、根据本发明的另一个方面，提供上述检测侵袭性真菌的组合物在制备检测侵袭性真菌的试剂盒中的用途。

8、优选地，上述侵袭性真菌包括镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌。

9、根据本发明的另一个方面，提供一种检测侵袭性真菌的试剂盒，包括上述检测侵袭性真菌的组合物。利用本发明提供的组合物构建检测侵袭性真菌的试剂盒，能够实现对镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌的精确检测，达到较高的特异性和灵敏度。

10、根据本发明的另一个方面，提供一种以非诊断目的检测侵袭性真菌的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：s1、提取或释放待测样本的核酸，得到核酸样本；s2、使用上述检测侵袭性真菌的组合物对核酸样本进行荧光定量pcr扩增；s3、获得并分析结果。应用本发明所提供的组合物对镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌进行检测时，操作简单迅速，能够达到较高的准确率和灵敏度。

技术特征：

1.一种检测侵袭性真菌的组合物，其特征在于，包括如seq id no:1～3所示的检测镰刀菌的上下游引物及探针，和/或，如seq id no:4～6所示的检测荚膜组织胞浆菌的上下游引物及探针，和/或，如seq id no:7～9所示的检测毛霉目真菌的上下游引物及探针，和/或，如seq id no:10～12所示的检测隐球菌的上下游引物及探针。

2.如权利要求1所述检测侵袭性真菌的组合物，其特征在于，包括如seq id no:1～3所示的检测镰刀菌的上下游引物及探针、如seq id no:4～6所示的检测荚膜组织胞浆菌的上下游引物及探针、如seq id no:7～9所示的检测毛霉目真菌的上下游引物及探针和seq idno:10～12所示的检测隐球菌的上下游引物及探针。

3.如权利要求2所述检测侵袭性真菌的组合物，其特征在于，在所述检测侵袭性真菌的组合物中，各成分以混合的形式存在。

4.如权利要求1所述检测侵袭性真菌的组合物，其特征在于，所述检测侵袭性真菌的探针上连接有荧光报告基因。

5.如权利要求4所述检测侵袭性真菌的组合物，其特征在于，所述检测镰刀菌的探针的荧光报告基因为fam，所述检测荚膜组织胞浆菌的探针的荧光报告基团为hxe，所述检测毛霉目真菌的探针的荧光报告基团为rox；所述检测隐球菌的探针的荧光报告基因为cy5。

6.如权利要求1～5任一项所述检测侵袭性真菌的组合物在制备检测侵袭性真菌的试剂盒中的用途。

7.如权利要求6所述检测侵袭性真菌的组合物在制备检测侵袭性真菌的试剂盒中的用途，其特征在于，所述侵袭性真菌包括镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌。

8.一种检测侵袭性真菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～5任一项所述检测侵袭性真菌的组合物。

9.如权利要求8所述检测侵袭性真菌的试剂盒，其特征在于，所述侵袭性真菌包括镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌。

10.一种以非诊断目的检测侵袭性真菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明提供一种检测侵袭性真菌的组合物，包括如SEQ ID NO:1～3所示的检测镰刀菌的上下游引物及探针，和/或，如SEQ ID NO:4～6所示的检测荚膜组织胞浆菌的上下游引物及探针，和/或，如SEQ ID NO:7～9所示的检测毛霉目真菌的上下游引物及探针，和/或，如SEQ ID NO:10～12所示的检测隐球菌的上下游引物及探针。本发明提供的检测侵袭性真菌的组合物能够实现对镰刀菌、荚膜组织胞浆菌、毛霉目真菌、隐球菌的检测和区分，且特异性高，灵敏度高，这对于侵袭性真菌的快速诊断具有重要意义，在侵袭性真菌的检测领域有良好的应用前景。

技术研发人员：范一敏,王中书,孙青芝,谭德勇,吴康,戴立忠,刘佳
受保护的技术使用者：圣湘生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15