鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体及其应用

本发明属于食品安全检测，具体涉及鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体及其应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)是引起急性肠胃炎、腹泻和腹部绞痛的最常见病原体之一。鼠伤寒沙门氏菌在自然界分布较广，许多家禽、家畜、鼠类和野生鸟类的肠道中会存在这种细菌。人类通过食用被鼠伤寒沙门氏菌污染的食物或者是被感染鼠伤寒沙门氏菌的动物感染。对于免疫系统相对薄弱的婴儿或者老人，感染了鼠伤寒沙门氏菌可能存在致命的危险。因此，及时的发现和监测是遏制和减轻鼠伤寒沙门氏菌暴发的最有效策略。

3、核酸适配体(aptamer，也译为核酸识体、适配子、适配体)是指从人工合成的dna/rna文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。目前，已知核酸适配体是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(dna或rna)片段。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment，selex)技术；所述的selex技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段；相比抗体等多肽类的适配体(peptide aptamer)，核酸适配体的优势相当明显，如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。为了能够得到能识别天然构象下膜蛋白的核酸适配体，发展了以细胞为靶标的selex技术，即cell-selex。与传统selex针对单一分子进行筛选不同，cell-selex的靶标为一个完整的活细胞。

4、适配体的柔性结构使其易受环境中多种基质成分影响而改变其对靶标的识别和结合，因此提高适配体的亲和力和特异性是改善适配体和适配体-靶标复合物稳定性及抗基质干扰的有效途径。在基于适配体的检测方法中已发现食品中的蛋白质、离子体系、ph和带电基质会干扰适配体与靶标结合，为降低基质干扰，适配体在应用时需对样品进行复杂的前处理或针对特定样品建立标准曲线，但耗时长、人力物力浪费成为适配体在复杂样品中应用的瓶颈。因此，通过筛选抗基质干扰适配体成为其实际应用的突破点。

技术实现思路

1、为了克服上述问题，本发明以鼠伤寒沙门氏菌为筛选靶标，基于cell-selex技术，在筛选过程中选择典型食品基质：猪肉、蛋清、牛奶和小油菜分别作为负筛选靶标及筛选环境，结合大肠杆菌o157:h7、单增李斯特菌进行反筛选，经过多轮筛选获得了与鼠伤寒沙门氏菌高特异性结合的抗基质干扰核酸适配体。

2、本发明的第一方面，提供一种鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体的筛选方法，所述筛选方法包括：

3、(1)合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物：

4、所述随机单链dna文库：5’-accgaccgtgctggactc-(40n)-agtatgagcgagcgttgcg-3’，其中，40n代表40个随机核苷酸；

5、上游引物：5’-accgaccgtgctggactc-3’；

6、磷酸化下游引物：5’-p-cgcaacgctcgctcatact-3’；

7、(2)selex筛选特异核酸适体文库；

8、(3)pcr扩增文库；

9、(4)dna单链文库的制备；

10、(5)正向筛选；

11、(6)交替进行反向筛选与正向筛选；反向筛选完成后进行正向筛选，其中在反向筛选的过程中以分别大肠杆菌o157:h7和单增李斯特菌为反筛选靶标进行反向筛选；最后一次正向筛选后得与鼠伤寒沙门氏菌特异性结合的dna序列，即鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体。

12、在一种或多种实施方式中，所述步骤(5)和步骤(6)中，以猪肉、蛋清、牛奶和小油菜分别作为负筛选靶标及筛选环境。

13、本发明的第二个方面，提供由上述筛选方法获得的能够特异性结合鼠伤寒沙门氏菌的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如seq id no:1或seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或seq id no:5或seq id no:6或seq id no:7或seq id no:8或seq id no:9所示。

14、其中序列1：(seq id no:1)

15、cgtgctaggtagattatgggtgacggctggggttggcaat；

16、序列2：(seq id no:2)

17、ggaagggccgtcccagagacaagggctggcgcctcacaac；

18、序列3：(seq id no:3)

19、actgtgcggaagtccgcgtagtgatcacaacacgcgcggt；

20、序列4：(seq id no:4)

21、cgcgagacgacgtgtcgaacgctacatctctagatgtggg；

22、序列5：(seq id no:5)

23、tgcccgctctccattctggaatccgccccgcctcgggtgg；

24、序列6：(seq id no:6)

25、gaccagcctctcggccacccgaaaggctgatagcgcgacc；

26、序列7：(seq id no:7)

27、tattaacaatcggggctgatgagaattcgcattatgcggg；

28、序列8：(seq id no:8)

29、catcatgaaagagttctgtgccccagggtgtccgggtgcg；

30、序列9：(seq id no:9)

31、ggactaaggacgtagcgtctctgctcctcagatgtacctc。

32、本发明的第三个方面，提供上述核酸适配体在鼠伤寒沙门氏菌的分离、富集和检测中的应用；所述应用为非诊断和治疗目的。

33、本发明的第四个方面，提供上述核酸适配体在制备鼠伤寒沙门氏菌的检测试剂或者试剂盒中的应用。

34、本发明的有益效果在于：

35、本发明以鼠伤寒沙门氏菌为筛选靶标，基于cell-selex技术，在筛选过程中选择典型食品基质：猪肉、蛋清、牛奶和小油菜分别作为负筛选靶标及筛选环境，结合大肠杆菌o157:h7、单增李斯特菌进行反筛选，经过多轮筛选获得了与鼠伤寒沙门氏菌高特异性结合、抗基质干扰的核酸适配体，对核酸适配体的结构和性能进行了预测，最终确定了可实际应用的适配体。获得的核酸适配体通过适当的修饰或者标记，可用于鼠伤寒沙门氏菌的检测。