一种利用乙醇合成L-苏氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用

本申请属于基因工程，尤其涉及一种利用乙醇合成l-苏氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、二氧化碳的转化和利用是世界性的科学问题，融合人工光合成与合成生物学，通过利用太阳能为代表的可再生能源来驱动连续催化反应，以实现二氧化碳到太阳燃料和绿色化学品的转化，为解决能源短缺和环境污染问题开辟了新道路。l-苏氨酸的发酵严重依赖葡萄糖，随着人工光合成领域发展，光电催化等人工光合成体系可有效的利用可再生能源实现co2固定制备乙醇，若构建重组微生物菌株以乙醇为原料定向的合成l-苏氨酸，不仅能从根本上解决二氧化碳过度排放的问题，也可以解除发酵工业对葡萄糖等粮食来源的生物质能源的依赖。

2、苏氨酸是一种人体必须氨基酸，在保健领域和抗生素合成领域有着广泛的应用。同时，苏氨酸在饲料领域的市场需求量较大，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽私聊的第三限制氨基酸。目前苏氨酸的合成依赖于微生物发酵葡萄糖。但是受葡萄糖产苏氨酸的代谢通路的限制，葡萄糖发酵产苏氨酸的理论转化率仅有0.81g/g，这也造成了目前苏氨酸生物发酵的产率和原子经济性一直提不上去，一般只能达到0.5g/g。与葡萄糖相比，乙醇作为一种新兴的发酵底物，由它合成葡萄糖的理论转化率为接近100％，能有效提高发酵的产率，在工业生产中节约发酵成本。目前，有关于如何构建重组微生物菌株以利用乙醇进行l-苏氨酸的合成还鲜有报道。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用乙醇合成l-苏氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用，所述基因工程菌株通过过表达外源性的乙醇脱氢酶基因和乙醛脱氢酶基因，同时过表达来自大肠杆菌的内源性基因thra*bc和rhtc，能够利用乙醇生长并发酵得到l-苏氨酸。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种利用乙醇合成l-苏氨酸的基因工程菌株，所述基因工程菌株包括出发菌株、初始表达载体、启动子、外源性基因和内源性基因；

4、所述出发菌株包括大肠杆菌；

5、所述外源性基因包括乙醇脱氢酶基因和乙醛脱氢酶基因；

6、所述内源性基因包括thra*bc基因和rhtc基因。

7、可选地，所述初始表达载体包括prsfduet-1和/或pacyc184。

8、可选地，当所述初始表达载体为prsfduet-1时，所述启动子包括ptrc-tho，所述ptrc-tho的核苷酸序列如seq id no.1所示；

9、当所述初始表达载体为pacyc184时，所述启动子包括parabad，所述parabad的核苷酸序列如seq id no.2所示。

10、可选地，所述乙醇脱氢酶基因的ncbi的登录号为genbank:wp_012885841；

11、所述乙醛脱氢酶基因的ncbi的登录号为genbank:np_014032；

12、所述thra*bc基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；

13、所述rhtc基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

14、可选地，所述thra*bc基因中的thra*是宿主细胞基因组中的thra基因的1034位碱基替换为碱基t。

15、可选地，所述thra*bc基因编码天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶。

16、可选地，所述rhtc基因编码l-苏氨酸胞外转运蛋白。

17、第二方面，本发明提供了上述基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

18、步骤1)将所述外源性基因和内源性基因与初始表达载体、启动子连接，得重组过表达载体；

19、步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株中，得所述基因工程菌株。

20、可选地，步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株的感受态细胞中。

21、可选地，步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株中后，还包括用抗生素进行筛选的步骤。

22、第三方面，本发明提供了上述基因工程菌株在利用乙醇合成l-苏氨酸及其衍生物中的应用。

23、第四方面，本发明提供了一种利用乙醇合成l-苏氨酸的方法，包括如下步骤：

24、将上述的基因工程菌株接种至培养基中进行生物发酵，得所述l-苏氨酸。

25、可选地，所述基因工程菌株的接种量为0.2～30od600。

26、优选地，所述基因工程菌株的接种量为2～30od600。

27、可选地，所述基因工程菌株的接种量独立地选自0.2od600、1od600、2od600、5od600、10od600、15od600、20od600、25od600、30od600中的任意值或任意两者之间的范围值。

28、可选地，所述培养基中包括乙醇；

29、所述乙醇的初始加入量为5～20g/l。

30、优选地，所述乙醇的初始加入量为8～12g/l。

31、可选地，所述乙醇的初始加入量独立地选自5g/l、8g/l、10g/l、12g/l、14g/l、16g/l、18g/l、20g/l中的任意值或任意两者之间的范围值。

32、可选地，所述培养基中还包括磷酸盐、镁盐、螯合剂和微量元素。

33、可选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钾和磷酸氢二铵。

34、可选地，所述镁盐包括硫酸镁。

35、可选地，所述螯合剂包括edta。

36、可选地，所述微量元素选自可溶性的钴盐、锰盐、铜盐、钼盐、锌盐、铁盐和硼酸中的一种或多种。

37、可选地，所述生物发酵在有氧条件下进行。

38、可选地，所述生物发酵的温度为27～45℃。

39、优选地，所述生物发酵的温度为30～37℃。

40、可选地，所述生物发酵的时间不小于24h。

41、可选地，所述生物发酵过程中控制培养基的ph为6～7.5。

42、与现有技术相比，本发明包括以下有益效果：

43、(1)本发明提供的基因工程菌株以大肠杆菌为出发菌株，引入了外源性的乙醇脱氢酶基因和乙醛脱氢酶基因，同时过表达了来自大肠杆菌的内源性基因thra*bc和rhtc，能够利用乙醇生长并积累l-苏氨酸，克服了现有技术中微生物不能利用乙醇进行发酵的缺陷。

44、(2)采用本发明提供的基因工程菌株能够在胞外生产大量l-苏氨酸，l-苏氨酸的产量达到9.6g/l，转化率为0.67g/g，相较于目前工业上生产l-苏氨酸的0.5g/g转化率提高了34％。

技术特征：

1.一种利用乙醇合成l-苏氨酸的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株包括出发菌株、初始表达载体、启动子、外源性基因和内源性基因；

2.根据权利要求1所述的一种利用乙醇合成l-苏氨酸的基因工程菌株，其特征在于，所述初始表达载体包括prsfduet-1和/或pacyc184。

3.根据权利要求2所述的一种利用乙醇合成l-苏氨酸的基因工程菌株，其特征在于，当所述初始表达载体为prsfduet-1时，所述启动子包括ptrc-tho，所述ptrc-tho的核苷酸序列如seq id no.1所示；

4.根据权利要求1所述的一种利用乙醇合成l-苏氨酸的基因工程菌株，其特征在于，所述乙醇脱氢酶基因的ncbi的登录号为genbank:wp_012885841；

5.权利要求1～4任意一项所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤2)将所述重组过表达载体转入出发菌株的感受态细胞中；

7.权利要求1～4任意一项所述的基因工程菌株在利用乙醇合成l-苏氨酸及其衍生物中的应用。

8.一种利用乙醇合成l-苏氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的一种利用乙醇合成l-苏氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌株的接种量为0.2～30od600；

10.根据权利要求8所述的一种利用乙醇合成l-苏氨酸的方法，其特征在于，所述培养基中包括乙醇；

技术总结
本申请公开了一种利用乙醇合成L‑苏氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的基因工程菌株包括出发菌株、初始表达载体、启动子、外源性基因和内源性基因；所述出发菌株包括大肠杆菌；所述外源性基因包括乙醇脱氢酶基因和乙醛脱氢酶基因；所述内源性基因来自大肠杆菌的基因组。本发明提供的基因工程菌株能够利用乙醇生长并积累大量L‑苏氨酸，克服了现有技术中微生物不能利用乙醇进行发酵的缺陷。

技术研发人员：李灿,王旺银,王迎晨
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15