反枝苋ABCG5基因及应用

本发明涉及基因工程，具体地说，涉及反枝苋abcg5基因及其应用。

背景技术：

1、反枝苋，苋科苋属一年生c4植物，是我国大豆玉米等秋熟作物田常见杂草，在我国东北大豆田分布广泛。因其适应性强、传播方式多样、生长迅速、4叶期后无特效除草剂及大豆迎茬种植的特点，成为大豆田恶性杂草，严重影响大豆产量与品质。一般可使大豆减产20％，危害严重时，会使大豆减产50％以上。

2、目前，大豆田使用的阔叶杂草除草剂主要是ppo抑制剂类除草剂。氟磺胺草醚因其除草效率高、选择性好、杀草谱宽等优点，成为我国大豆田防除包括反枝苋在内的阔叶杂草的主要除草剂。但是，随着该除草剂的常年大量使用，部分反枝苋种群对其产生了抗性。滕春红等对黑龙江省反枝苋进行氟磺胺草醚敏感性测定，发现部分反枝苋种群对其产生5-100倍抗性；随后反枝苋对氟磺胺草醚的高抗性也多有报道。

3、目前为止已有14种杂草对ppo抑制剂产生了抗性，其中有7种杂草有报道对ppo抑制剂产生抗性的作用机理，主要报道是靶标抗性机理。包括靶标基因ppx2中δgly210、arg128、val361、gly399，ppx1中ala212位突变。目前关于反枝苋对ppo抑制剂作用机理的报道主要是其靶标基因ppx2中arg128位突变。abc转运蛋白通过对除草剂及其代谢物进行区隔而赋予除草剂抗性。实验室生成的abcb或abcg家族的拟南芥转运体变体可以对抗生素卡那霉素、一些辅酶、二硝基苯胺除草剂、百草枯产生抗性。abcg5是非生物胁迫下生长和发育的重要转运体，在受到高温、低温、干旱、赤霉素等非生物胁迫处理后，abcg基因在幼苗、嫩芽、根部上调以应对它们带来的不利影响。在研究对氟磺胺草醚具有非靶标抗性的反枝苋种群时，我们发现除草剂处理后abcg5基因在抗性种群中的表达量显著高于敏感种群。因此，我们推测abcg5基因可能响应了反枝苋对氟磺胺草醚的代谢过程。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是提供一个全新或功能信息未知的反枝苋代谢ppo抑制剂类除草剂的abc转运蛋白基因abcg5。

2、本发明是基于反枝苋种群(r，s1)的二代测序(rna sequencing)分析，blast工具比对，pcr克隆及序列测定后获得的代谢解毒ppo抑制剂类除草剂基因abcg5，所述基因功能为可以在植物体内代谢解毒ppo抑制剂类除草剂尤其是在反枝苋体内代谢解毒氟磺胺草醚。

3、所述的基因abcg5的代谢解毒具体包括：(1)该基因在抗性反枝苋种群(r)中的表达量显著高于在敏感反枝苋种群(s1)中的表达；(2)该基因在抗性反枝苋种群(r)中的表达量显著高于在三个敏感种群(s1，s2，s3)中的表达量。进一步地，该基因在拟南芥中过表达后，转基因拟南芥对氟磺胺草醚的耐受性高于野生型拟南芥。

4、因此，本发明提供一种反枝苋abcg5基因，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、优选地，所述反枝苋abcg5基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，或其经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或与seq id no.1所示核苷酸序列90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

6、本发明提供所述的abcg5基因编码的蛋白。

7、同时，本发明还提供一种鉴定反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂抗性中的方法，其检测abcg5基因表达量，根据其相对表达量来鉴定不同反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂的抗性。

8、优选地，所述ppo抑制剂类除草剂为氟磺胺草醚。

9、具体地，所述检测abcg5基因表达量的方法包括：

10、(1)待测反枝苋的总rna提取与cdna反转录；

11、(2)根据abcg5基因设计荧光定量qpcr引物；

12、(3)检测待测反枝苋中abcg5基因的表达量；

13、(4)计算abcg5基因不同反枝苋材料中的相对表达量；计算结果，相对表达量越高则抗性越高，相对表达量越低则抗性越低。。

14、任选地，还包括对18s基因作为内参基因的检测。

15、更具体地，abcg5基因与内参基因18s基因的qpcr引物如下：

16、abcg5-f(seq id no.3):5’-gttgatgtgcttcttgatttgg-3’；

17、abcg5-r(seq id no.4):5’-gatttcggcttgtgctttg-3’；

18、18s-f(seq id no.5)：5’-agtggatgcacccagtatt-3’；

19、18s-r seq id no.6：5’-tcgatggttcacgggatt-3’。

20、在具体实施方式中，qpcr反应体系和反应程序如下：

21、qpcr的反应体系以20μl计：2×perfectstart green qpcr supermix 10μl，上下游引物10μmol各0.4μl，50×passive reference dye 0.4μl，无菌水8.2μl，模板cdna1μl。

22、qpcr程序设定选择两步法：94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃引物退火34s并进行荧光信号采集，共40个循环；随后进入溶解曲线反应。

23、本发明还提供所述反枝苋abcg5基因在培育对ppo抑制剂类除草剂抗性的植株或品种中的应用，其在目标植物中过表达所述反枝苋abcg5基因以获得对ppo抑制剂类除草剂抗性增强的转基因植株或培育成植物品种；优选地，所述ppo抑制剂类除草剂为氟磺胺草醚；所述植物是大豆或玉米。

24、本发明优点如下：

25、1、本发明首次从反枝苋中克隆了一种abc转运蛋白基因，该基因与藜麦、菠菜、甜菜中的abcg5基因高度同源，且转录组结果表明在具有代谢抗性的反枝苋种群中的表达量显著高于对氟磺胺草醚敏感的种群，可用于初步确认abcg5基因能赋予反枝苋对氟磺胺草醚的代谢抗性。

26、2、本发明基于反枝苋abcg5基因序列设计引物，并采用qpcr的方法检测了反枝苋种群不同样本中abcg5基因的表达量。检测结果与转录组数据基本一致，验证了abcg5基因及其引物可用于反枝苋抗除草剂基因的研究及确定。

27、3、将反枝苋abcg5基因在拟南芥中进行过表达并测定转基因拟南芥对氟磺胺草醚的敏感性，验证abcg5基因的功能。

技术特征：

1.一种反枝苋abcg5基因，其特征在于，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的反枝苋abcg5基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1所示，或其经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或与序列1所示核苷酸序列90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的abcg5基因编码的蛋白。

4.一种鉴定反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂抗性中的方法，其特征在于，检测abcg5基因表达量，根据其相对表达量来鉴定不同反枝苋材料对ppo抑制剂类除草剂的抗性。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述ppo抑制剂类除草剂为氟磺胺草醚。

6.根据权利要求4或5 所述的方法，其特征在于，所述检测abcg5基因表达量的方法包括：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括对18s基因作为内参基因的检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，abcg5基因与内参基因18s基因的qpcr引物如下：

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，qpcr反应体系和反应程序如下：

10.根据权利要求1或2所述反枝苋abcg5基因在培育对ppo抑制剂类除草剂抗性的植株或品种中的应用，其特征在于，其在目标植物中过表达所述反枝苋abcg5基因以获得对ppo抑制剂类除草剂抗性增强的植株或培育成植物品种；优选地，所述ppo抑制剂类除草剂为氟磺胺草醚；所述植物是大豆或玉米。

技术总结
本发明公开了反枝苋ABCG5基因及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明还公开了用于检测反枝苋ABCG5基因表达量的荧光定量PCR引物以及检测反枝苋ABCG5基因表达量的方法，以此判断反枝苋对氟磺胺草醚等PPO抑制剂类除草剂的抗性，该方法具有简便、灵敏度高、特异性强的优点，在反枝苋对氟磺胺草醚非靶标抗性的检测和研究中具有重要的应用前景。本发明首次揭示了反枝苋ABCG5基因与PPO抑制剂类除草剂抗性之间的关系，可通过检测反枝苋ABCG5基因的表达量来鉴定反枝苋对除草剂是否产生代谢抗性，对及时发现抗性并指导农田科学用药及缓解抗药性进一步蔓延具有指导意义。

技术研发人员：黄兆峰,曹艺,李香菊,魏守辉,黄红娟,崔海兰,兰宇宁
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25