一种紫点海葵多肽毒素HC-G01及其合成方法

本发明涉及多肽毒素，具体为一种紫点海葵多肽毒素hc-g01及其合成方法。

背景技术：

1、关于海葵的化学成分的研究始于20世纪70年代，而国内对海葵的研究起步相对较晚。我国是在1980年有关单位民间普查时发现沿海渔民用海葵治病的情况，然后进行了一系列药理实验，发现海葵毒素确实具有高价值的生物活性，才逐步开始了对海葵毒素的研究。但其实早在我国古代就已发现和应用其药理活性了，据《中华本草》和《中国药用动物志》记载，海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效，中医用来治疗脱肛、痔疮、蛲虫病等。海葵能镇静、止咳、降压、抗凝、抗菌、抗癌、兴奋平滑肌，甚至还有“通乳下奶”作用。民间还常用鲜海葵治疗痔疮、蛲虫病、体癣等，具有较好的疗效。

2、岩沙海葵毒素是已知非蛋白毒素中毒性最强烈的毒素，中毒部位主要发生在神经系统和心脏，可引起心脏和呼吸功能的衰竭，但它同时也具有很高的抗癌活性和很强的溶血作用，是已知最有效且有特异性的细胞膜活性剂。来自黄海葵的ap-a和ap-b是具有强心作用、增强收缩心肌作用的典型代表，其活性远强于毒毛旋花苷，是具潜力的抗心功能衰竭候选药物。目前ap类强心多肽正用于开发充血性心力衰竭和肌无力的治疗。据研究调查，将生活在热带和亚热带水域的彩色地毯海葵（ stichodactyla haddoni）中的肽毒素通过蛋白测序和cdna克隆，分离到了具有麻痹蟹活性的shtx i-iii和具有蟹致死活性的shtx iv四种肽毒素，并鉴定了它们的一级结构。shtxi和ii是具有钾通道毒性的新型毒素，shtx iii被证实具有抑制胰蛋白酶的作用，其抗胰蛋白酶活性为203 iu/mg，是具有钾通道毒性的kunitz型蛋白酶抑制剂。

3、而现有技术中对于已发现的紫点海葵多肽库中具有活性的短肽的生物活性探究较为贫瘠，无法基于紫点海葵多肽库进行有效合成，而少有的合成多肽毒素缺乏对于医用性研究，因此亟需一种紫点海葵多肽毒素来解决此类问题。

技术实现思路

1、（一）解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种紫点海葵多肽毒素hc-g01及其合成方法，解决现有技术中存在的无法基于紫点海葵多肽库进行有效合成，而少有的合成多肽毒素缺乏对于医用性研究的问题。

3、（二）技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现，本发明提供了一种紫点海葵多肽毒素hc-g01，其序列为qscprchrrdhfgkcrkldpcpd，二硫键的连接方式c1-c3和c2-c4。

5、本发明还提供一种上述紫点海葵多肽毒素hc-g01的合成方法，包括以下步骤：

6、步骤1、构建紫点海葵多肽库，从多肽库中取样多肽序列，通过同源比对法进行短肽筛选，对筛选后的短肽进行分子固定、筛选洗涤获取原始多肽，将取代率为0.337 mmol/g的amide-am树脂，用二氯甲烷（dcm）浸泡后，再依次用dmf和dcm洗涤，以二甲基甲酰胺作为助溶剂；

7、步骤2、加入用助溶剂溶解的oxyma、用助溶剂稀释后的活化剂dic和哌啶，按照序列在步骤1中浸泡后的树脂加入适量用助溶剂dmf溶解的所需氨基酸，以acm作为半胱氨酸的保护基，通过cem全自动微波多肽自动合成仪将氨基酸从羧基端到氨基端合成树脂肽：qsc(acm)prchrrdhfgkc(acm)rkldpcpd，其中dic浓度在0.6mol/l-1.8mol/l，哌啶浓度在1.1mol/l-1.3mol/l；

8、步骤3、以三氟乙酸（tfa）﹕乙二胺四乙酸（edta）﹕三异丙基硅烷（tips）﹕水=95.0%﹕2.0%﹕2.0%﹕1.0%的比例配制切割液；

9、步骤4、将上述步骤2中得到的树脂肽去掉废液，用二氯甲烷洗涤3次，倒入离心管中，切割、过滤掉树脂；

10、步骤5、将滤液逐滴加入冰乙醚中形成沉淀，离心弃上层乙醚清液，重复此操作洗涤3次，得到粗品多肽；

11、步骤6、将粗品多肽进行柱色谱分离纯化，流动性a为乙腈、b为纯水，洗脱45 min，检测波长为220 nm，经反复纯化后-80℃冷冻干燥，得到纯线性肽；

12、步骤7、在通风橱内，将线性肽溶解于甲醇-水，加入乙酸，混合均匀且呈透明澄清，然后边搅拌边滴加以纯甲醇为溶媒的碘液，至出现淡黄色且不褪色时立即停止滴加，再继续搅拌一分钟后，第一对二硫键形成，整个过程均在避光条件下进行；

13、步骤8、将氧化折叠完成形成一对二硫键的肽液加等体积的盐酸溶液，再加入余下的以纯甲醇为溶媒的碘液，搅拌90min，形成第二个二硫键，反应完成后，边搅拌边向溶液中加入适量l(+)-抗坏血酸中和过量碘，褐色溶液随即逐渐褪至无色，猝灭反应；

14、步骤9、将上述的线性肽、氧化折叠好的氧化肽都进行质谱鉴定。

15、本发明进一步地，所述步骤1中，称取树脂为2754.19 mg，二氯甲烷dcm浸泡时长为10 min；

16、本发明进一步地，所述步骤2中，称取4.26g oxyma用30ml助溶剂溶解，量取3ml活化剂dic和20ml哌啶分别用助溶剂稀释到40ml和100ml，按照序列分别称取精氨酸2.73g、天冬氨酸0.66g、半胱氨酸（带acm）0.71g、谷氨酸0.37g、甘氨酸0.18g、组氨酸0.75g、亮氨酸0.22g、赖氨酸0.57g、苯丙氨酸0.24g、脯氨酸0.54g、丝氨酸0.24g、半胱氨酸0.50g，用助溶剂溶解；

17、本发明进一步地，所述步骤4中，所述切割是按照每20 mg树脂肽加入1 ml切割液的配比于40℃下切割40 min；

18、本发明进一步地，所述步骤5中，滤液逐滴加入20倍体积的-20℃冰乙醚中形成沉淀，以12000 rpm、0℃离心5 min弃上层乙醚清液；

19、本发明进一步地，所述步骤6中，所述柱色谱分离纯化是将粗品多肽进行柱色谱分离纯化，以5 ml/min的流速，5%-50%乙腈梯度洗脱45 min；

20、本发明进一步地，所述步骤7中，分析天平称取10 mg线性肽溶解于1 ml 50%的甲醇-水，完全溶解后加9 ml的乙酸，混合均匀且呈透明澄清，然后边搅拌边滴加以纯甲醇为溶媒的10 mg/ml的碘液，配制碘液时需用锡纸包裹避光；

21、本发明进一步地，所述步骤8中，将氧化折叠完成形成一对二硫键的肽液加等体积的50 mmol/l的盐酸溶液，再加入余下的以纯甲醇为溶媒的10 mg/ml的碘液2 ml，以150r/min的速度搅拌90min。

22、（三）有益效果

23、本发明提供了一种紫点海葵多肽毒素hc-g01及其合成方法。具备以下有益效果：

24、通过同源比对法在已建立的海葵毒素多肽库中对大量海葵毒素进行初步筛选找到拟具有活性的多肽毒素后，用fmoc固相合成法合成毒素hc-g01的线性肽，经碘氧化法氧化折叠成具有活性的多肽毒素，将两个二硫键连接成功的氧化肽经高效液相色谱仪（hplc）制备纯化且质谱鉴定正确后采用注射法、热板法和dpph清除自由基的方法依次验证其对斑马鱼的致死性、镇痛和抗氧化活性，成功合成了含有两个二硫键且具有天然构型的氧化肽hc-g01。

25、此多肽毒素的多活性筛选实验表明，hc-g01对斑马鱼有一定的毒性，其半数致死量ld50为21.06 mg/kg；对小鼠有一定的镇痛作用，其半数有效量ed50为23.79 mg/kg；在dpph清除自由基活性实验中表现良好，其肽液浓度为5 mg/ml的清除率即可达到90%以上，从海葵多肽库中筛选并合成的hc-g01表现出的有价值的活性是对斑马鱼致死性、镇痛和抗氧化，为新药研发和探索海葵毒素作用靶点提供更多数据。

26、解决了现有技术中心存在的无法基于紫点海葵多肽库进行有效合成，而少有的合成多肽毒素缺乏对于医用性研究的问题。