用于分析生物样品的标记物和方法与流程

本发明涉及一种用于标记生物样品或标记包含生物样品的离散实体的标记物和方法。

背景技术：

1、人体包含数百种终末不同的细胞类型，例如诸如肌细胞、肠上皮细胞和浦肯野神经细胞，其基本上共享相同的基因组，但表现出显著不同的表型。根本上，这些表型与这些细胞内如基因组(dna)、转录组(rna)、蛋白质组(蛋白质)等不同类别分子之间的分子相互作用有关。

2、随着二代测序平台的出现，单细胞rna测序和其他单细胞多组学技术紧随其后，并允许对这些测量数百、数千甚至“全基因组”(约20000个蛋白质编码基因)的数据层进行大规模平行测量。这些方法被统称为多组学。虽然这些测量对绘制转录细胞状态空间非常有用，且越来越多地提供大规模对其它数据层的访问，但它们依赖于将组织分离为细胞悬浮液。然而，组织分离将细胞从其环境中移出，失去了自分泌、旁分泌和近分泌信号输入，并切断了细胞与细胞外基质的连接，因此对细胞具有极大影响。在悬浮液中的细胞会立即成为圆形并且不再显示正常的细胞形态。这些变化同样影响以上描述的多种分子层。

3、这一缺点激发了对在组织环境中能够类似地进行多组学表征的技术的兴趣。目前可用的技术包括蛋白质多路复用(protein multiplexing)、成像质量流式细胞术/多路离子束成像(mibi/imc)、各种基于单分子荧光原位杂交(fish)的方法(如merfish、se-qfish)和空间分析方法，如10x genomics的visium平台或nanostring的geomx。上述方法都不能在组织切片内的单个水平上测量全转录组，因为复用(plexing)或空间分辨率不够高。

技术实现思路

1、本发明的目的为提供一种能够以有效且快速的方式在不同类型的分析之间追踪生物样品的标记物和方法。

2、上述目的是通过独立权利要求的主题来实现的。优异的实施例在从属权利要求和以下描述中被限定。

3、本发明克服了所述限制，并提供了一种将细胞表型与多组学，特别是单细胞rna测序和atac测序的测量相关联的手段。重要的是，本发明使用了兼容于组织样品或细胞悬浮液样品或颗粒悬浮液样品的标记物以标记和分析这些样品。另一个方面是可以生成大量唯一的标记物，其可以通过显微镜和通过二代测序(ngs)等dna测序被读出。因此，本发明允许大规模地进行表观组-到-多组学的表征。

4、一方面中，提供了一种用于标记生物样品或标记包含所述生物样品的离散实体的标记物，所述标记物包含寡核苷酸纳米结构骨架，所述寡核苷酸纳米结构骨架在预定位置具有多个附着位点。此外，所述标记物包含：多个标签，所述多个标签用于附着至所述多个附着位点中的至少一些；和至少一个第一方位指示器和至少一个第二方位指示器。每个标签包含至少一种染料、寡核苷酸编码部分和寡核苷酸附着部分，所述寡核苷酸编码部分被配置成编码所述至少一种染料的特征，所述寡核苷酸附着部分被配置成可逆地将标签附着于所述多个附着位点中的一个附着位点。此外，每个标签的所述寡核苷酸附着部分包含唯一(unique)寡核苷酸序列，所述唯一寡核苷酸序列被配置成结合至所述多个附着位点中的一个附着位点的互补序列。

5、例如，寡核苷酸是单链dna或rna分子，可以对其进行测序以确定其核苷酸序列。寡核苷酸的互补部分可以相互杂交或结合。优选地，所述生物样品包含至少一个细胞。

6、所述方位指示器被配置成附着于所述骨架，并且可以用于可视地确定所述标记物在空间中的方位。所述寡核苷酸编码部分是唯一的核酸序列，其对所述标签的至少一种染料的激发/发射波长和/或荧光寿命是唯一的。因此，通过标记物的每个标签中染料及其特异附着位点的唯一组合，所述标记物是可视化地可明确识别的。通过对唯一寡核苷酸编码部分和寡核苷酸附着部分进行测序，相同的标记物是明确可识别的。

7、优选地，所述离散实体由聚合化合物组成。所述聚合化合物可以被聚合以形成该离散实体。特别地，所述聚合化合物可以形成水凝胶。离散实体或水凝胶珠的直径可以在10μm至10mm的范围内。特别优选的范围为10μm至100μm、50μm至250μm和500μm至5mm。这使得生物样品能够在结合了3d悬浮细胞培养和基于支架的细胞培养的优点的“基于支架的悬浮3d细胞培养”中嵌入和培养离散实体。

8、优选地，所述纳米结构骨架包含支架链(scaffold strand)和装订链(staplestrand)，所述装订链被配置成在预定位置结合至支架链以将支架链折叠为预定形状。所述纳米结构骨架可以为dna折纸(origami)。这些dna折纸结构可以在几纳米到几微米的大小范围内。为了制造这种基于dna折纸的结构，较长的dna分子(支架链)通过所谓的装订链在精确识别的位置被折叠。dna折纸可以被设计成提供特定的预定形状的自组装纳米结构骨架。这使得骨架的合成和组装简单且可重复。装订链可以是位置选择性地功能化的。在这种情况下，位置分辨率受到核苷酸大小的限制，其在纳米或纳米以下的范围内。这已经在现有技术中被用于生成荧光标准物，其中荧光染料连接至dna折纸上精确定位的条带。这些标准物被称为“纳米尺”，并用于成像系统的校准，例如如us2014/0057805a1所公开的，如共聚焦或超分辨率显微镜(例如sted)。

9、dna折纸为标签提供了支架。优选地，所述dna折纸结构包含至少一条支架链和多条装订链，其中所述装订链与所述支架链的至少一部分互补并被配置成使所述支架链形成预定构象。特别地，所述链是寡核苷酸。这使得能够生成具有可自组装的预定二维或三维形状的纳米结构骨架。此外，这使得附着位点能够在所述骨架上位点特异性放置。

10、附着位点是唯一的核酸序列，优选为装订链的。优选地，所述标签可以在预定的附着位点附着到纳米结构骨架的装订链上。由于所述装订链被定位于预定位置，因此附着位点的位置可以同样地预先确定。因此，附着位点是与单个标签的寡核苷酸附着部分互补的唯一寡核苷酸序列。

11、优选地，纳米结构骨架的最大空间限度(extent)在10nm至10000nm的范围内，优选在0.1μm至5μm的范围内。这使得所述标记物特别紧实。

12、优选地，所述多个附着位点以1nm至2000nm的范围、优选以200nm至1000nm的范围彼此隔开。这使得标签在纳米结构骨架上的排列特别密集。附着位点之间的间隔可以依据用于读出标签的读出装置的分辨率选择。特别优选的范围可以对应于不同显微镜模式可得的横向分辨率，诸如例如单分子定位显微镜(1nm至25nm)、结构照明显微镜和sted显微镜(50nm至100nm)、高na(numerical aperture，数值孔径)光学显微镜(约200nm)和低na光学显微镜(约500nm)。重要的是，标签可以彼此远离，因此读出设备可以分别地解析标签。

13、优选地，标签包含引物序列，所述引物序列被配置成使所述附着部分和所述编码部分能够被测序，优选地，所有标签都包含相同的所述引物序列。这使得所述部分的测序特别高效。

14、优选地，每个标签包含切割位点，所述切割位点被配置成使所述染料与所述标签分开。所述切割位点可以允许酶、温度或光诱导的切割。这使得能够有效地从标签的所述部分去除染料，尤其是在对所述部分进行测序之前。

15、优选地，所述染料为荧光基团。优选地，每个标签拥有具有不同特征(例如激发波长、发射波长和荧光寿命中的至少一个)的一个或多个荧光基团，以使得能够生成大量的不同标记物。根据优选实施例，所述染料为申请号为pct/ep2021/073819的专利申请中描述染料的组合，其全部内容通过引用并入本文。

16、优选地，所述标记物包含锚定部分，所述锚定部分被配置成将所述标记物附着于所述生物样品的特异性生物特性。例如，所述锚定部分可以是寡核苷酸(所述标签的一部分或所述纳米结构的一部分)，其被配置成附着到所述生物样品的基因组序列。例如，这使所述标记物能够定位在细胞核中。

17、优选地，所述纳米结构骨架在一个维度线性延伸，并且所述第一方位指示器和所述第二方位指示器彼此隔开或被布置在所述纳米结构骨架的相对端。这使得能够确定所述标记物的方位。例如，所述方位指示器可以包含荧光染料。特别地，第一方位指示器和第二方位指示器具有不同的性质，例如激发波长、荧光发射波长和/或荧光寿命。

18、优选地，所述纳米结构骨架在两个维度或三个维度延伸，并且所述纳米结构骨架包含至少一个第三方位指示器。这使得能够确定所述标记物的方位。

19、在另一方面中，提供了一种用于分析生物样品的方法，包括以下步骤：将多个根据前述权利要求中的一项所述的标记物引入所述生物样品或包含所述生物样品的离散实体；获取所述生物样品和标记物的至少一个光学读出；基于每个标记物中每个所述标签的所述至少一种染料、特别是基于每个标签的荧光特征及其特定的附着位点，在所述生物样品的至少第一部分的所述光学读出中，确定与所述样品的所述第一部分相关的独特(individual)标记物；将所述生物样品或所述离散实体分离为多个样品分离部分并将所述多个样品分离部分分开；对所述多个样品分离部分中的至少一个部分的遗传内容物与各自相关的标记物的寡核苷酸编码部分和寡核苷酸附着部分一同进行测序，以生成测序数据；在所述测序数据中确定存在所述寡核苷酸附着部分和所述寡核苷酸编码部分的序列；和基于存在所述序列和存在于所述生物样品的所述第一部分中的所述独特标记物，将所述测序数据与所述生物样品的所述第一部分相关联。

20、所述被引入的标记物优选地通过其标签和/或纳米结构上所述标签的位置相区分，这意味着所述标签的特定附着位点。所述标签可以完全组装地被引入所述样品中，或它们可以被原位组装。所述光学读出优选地为图像堆栈(stack)或3d图像。

21、所述分离可以包括移除所述离散实体。所述样品分离部分可以是单个细胞或小的细胞簇。

22、这使得将来自所述光学读出的表观信息与来自所述测序数据的基因分型信息相联系。

23、当所述生物样品被嵌入在所述离散实体中，例如聚合化合物，特别是水凝胶中时，所述相关的标记物和所述生物样品保持非常接近。这使得能够特别容易地使用所述标记物处理所述生物样品。对于包含生物样品的离散实体和用于对所述包含生物样品的离散实体成像的通用方法的进一步实例，参考申请pct/ep2021/058785和pct/ep2021/061754，其内容通过引用完全并入本文。

24、光学读出可以是基于图像的读出，其可以使用显微镜来获取，如点扫描共聚焦或基于相机/广域成像系统，例如旋转圆盘显微镜、薄片荧光显微镜、光场显微镜和立体显微镜。此外，光学读出可以不是基于图像的读出，例如在具有至少一个点检测器或线检测器的细胞仪或基于流式的读出装置中。读出可以由离散读出组成，例如发射光谱或图像堆栈的单个采集。读出可以是数据读出流，例如在点扫描共聚焦或细胞仪中，其基本上是连续的。此外，读出可以是一系列图像，例如光谱或超光谱图像堆栈，其中每个图像的不同波长带的荧光发射被记录。

25、光学读出可以通过用于进行荧光多色读取或成像的读出装置生成。所述读出装置通常包括至少一个激发光源和包括至少一个检测通道的检测系统，并且还可以包括滤波器和/或色散光学元件，例如棱镜和/或光栅，以将激发光源发送到样品和/或将样品的发射光源发送到一个或多个检测器或检测器的适当区域。所述检测系统可以包括数个检测信道，可以是并平行检测所述光谱的多个频带的光谱检测器，或者是检测所述光谱的连续部分的超光谱检测器。检测系统包含至少一个检测器，其可以是点检测器(例如光电倍增管、雪崩二极管、混合检测器)、阵列检测器、照相机和超光谱照相机。检测系统可以像在细胞仪中典型的情况那样记录每个通道的强度，或者可以像在平板读取器或显微镜中那样是记录图像的成像检测系统。具有一个检测器(例如照相机或光电倍增管)通道的读出装置可以使用例如不同的激发和发射频带生成具有多个检测通道的读出。