一种T细胞及其制备方法和用途与流程

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种t细胞及其制备方法和用途。

背景技术：

1、肿瘤的免疫治疗为治疗癌症提供了一个新的角度，其利用宿主的免疫系统达到对抗癌症的目的，该疗法在2013年被《科学》杂志评为了年度科学突破。而过继性细胞治疗成为了肿瘤免疫治疗的主要方式。t细胞是人体内重要的免疫细胞，其通过特有的表面受体(tcell receptor，tcr)与病变细胞上的主要组织相容性复合体所呈递的抗原结合，从而识别异己。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，car)是模拟tcr的人工受体，可特异性靶向肿瘤表面抗原。目前已经有几款car-t产品上市，他们都是利用自体t细胞经过添加car来获得的。但自体car-t细胞操作复杂，生产成本昂贵，限制了car-t的推广。来自健康供者的t细胞活率高，易获得，可以制备成现货型产品，将会方便患者使用。但同种异体car-t会存在免疫排斥的现象，另外t细胞的耗竭问题也影响了car-t细胞的使用，因此获得同种异体car-t细胞需要敲除掉相关的免疫检查点相关基因和特异性受体基因。

2、基因编辑技术，特别是crisrp/cas9系统使得我们更加容易改造基因组序列。目前基因编辑技术已经在基因功能研究、遗传疾病治疗、肿瘤治疗等多个领域展现出了巨大的价值。crispr/cas9基因编辑技术基于cas9蛋白对dna双链进行切割，断裂的dna双链在修复时可引入插入或缺失突变，从而对靶基因进行敲除。然而研究表明，这种以dna双链断裂(dsb)为基础的遗传操作存在重大缺陷，可能导致百万碱基级别的染色体缺失，对人类细胞基因组造成全局性破坏。碱基编辑技术是在crispr/cas技术上融入了脱氨酶，通过对碱基脱氨在原位实现碱基编辑的目的。此种编辑方式不需要引入dna双链断裂，理论上更加安全。目前使用最广的是胞嘧啶碱基编辑(cytosine base editing,cbe)与腺嘌呤碱基编辑(adenine base editing，abe)，分别可以实现c到t的转换或者a到g的转换。另外一些类型的碱基颠换编辑器也可以实现c到g(c:g to g:c base editors,cgbe)或者a到c的颠换，这无疑增加了碱基编辑的类型。碱基编辑技术的提出迅速成为基因编辑领域炙手可热的工具。胞嘧啶碱基编辑可以作用于表达基因的基因编码区(coding sequence,cds)，通过靶向caa、cag、cga或tgg，产生终止密码子达到敲除基因的目的。cgbe可以通过靶向tac、tca产生终止密码子。除此之外，胞嘧啶碱基编辑、腺嘌呤碱基编辑和cgbe编辑器均可以通过靶向起始密码子atg或者ctg，或者破坏可变剪切位点(gt-ag)达到敲除基因的目的。然而一些碱基编辑工具存在脱靶问题，利用高效且高保真的碱基编辑工具将在改造通用型t细胞中显的尤为重要。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种t细胞及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种t细胞，所述t细胞中免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因经过碱基编辑，所述碱基编辑为利用碱基编辑系统对免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因的多核苷酸上的至少部分靶c碱基和/或靶a碱基脱氨基，以在基因编码区引入终止密码子或点突变起始密码子，或破坏可变剪切位点达到敲除免疫检查点相关基因或敲除编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因的目的。

3、本发明还提供一种用于制备所述t细胞的碱基编辑系统，所述碱基编辑系统包括：

4、(a)融合蛋白或其编码多核苷酸，所述融合蛋白中包括cas9片段和脱氨酶片段；

5、(b)引导核苷酸或其编码多核苷酸，其将a)中所述融合蛋白或其变体靶向至所述靶c碱基和/或靶a碱基，所述引导核苷酸的靶向序列为seq id no.1-seq id no.53。

6、本发明还提供所述的t细胞的制备方法，所述制备方法包括将免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因的多核苷酸与所述的碱基编辑系统相接触，利用脱氨酶片段将pdcd1、b2m、trac、trbc1和/或cd247基因的多核苷酸的至少部分靶c碱基和/或靶a碱基脱氨基。

7、本发明还提供所述的t细胞在制备通用型嵌合抗原受体t细胞中的用途。

8、所述通用型嵌合抗原受体t细胞是指同种异体嵌合抗原受体t细胞。

9、本发明还提供一种嵌合抗原受体t细胞，所述car-t细胞包括所述的t细胞以及嵌合抗原受体。

10、本发明还提供所述的t细胞或所述的嵌合抗原受体t细胞在制备预防或治疗自身免疫病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病、遗传疾病、传染性疾病或心血管疾病产品中的用途。

11、如上所述，本发明的一种t细胞及其制备方法和用途，具有以下有益效果：本发明可以克服crispr/cas技术引起的dna双链所造成的有害影响，利用高效且安全的碱基编辑技术，通过点突变的方式敲除原代t细胞的pdcd1、b2m、trac、trbc1或cd247。同时可以针对pdcd1，b2m和trac，或者pdcd1，b2m和trbc1，又或者pdcd1，b2m和cd247实现高达80％以上的同时敲除。同时利用碱基编辑敲除上述基因的细胞，其在dna与rna水平均没有检测到明显脱靶。利用本发明所述的编辑方法制备的t细胞产品，具有明显的应用前景和临床应用价值。

技术特征：

1.一种t细胞，其特征在于，所述t细胞中免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因经过碱基编辑，所述碱基编辑为利用碱基编辑系统对免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因的多核苷酸上的至少部分靶c碱基和/或靶a碱基脱氨基，以在基因编码区引入终止密码子或点突变起始密码子，或破坏可变剪切位点达到敲除免疫检查点相关基因或敲除编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因的目的。

2.根据权利要求1所述的t细胞，其特征在于，所述免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因选自pdcd1、b2m、trac、trbc1或cd247基因中的任一种或多种。

3.根据权利要求2所述的t细胞，其特征在于，所述pdcd1、b2m、trac、trbc1或cd247基因中的任意两个或两个以上基因同时经过碱基编辑。

4.根据权利要求1所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞包括以下任一项特征：

5.根据权利要求1所述的t细胞，其特征在于，所述碱基编辑系统为胞嘧啶碱基编辑系统、腺嘌呤碱基编辑系统或cgbe碱基编辑系统。

6.根据权利要求1所述的t细胞，其特征在于，所述t细胞为cd4+t细胞或cd8+t细胞。

7.根据权利要求1所述的t细胞，其特征在于，所述碱基编辑的靶多核苷酸包括如下任一个或几个所示的序列：seq id no.1～seq id no.53。

8.一种用于制备权利要求1-7任一所述的t细胞的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统包括：

9.权利要求1-7任一所述的t细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因的多核苷酸与权利要求8所述的碱基编辑系统相接触，利用脱氨酶片段将免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体基因的多核苷酸的至少部分靶c碱基和/或靶a碱基脱氨基。

10.权利要求1-7任一所述的t细胞在制备通用型嵌合抗原受体t细胞中的用途。

11.一种嵌合抗原受体t细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体t细胞包括权利要求1-7任一所述的t细胞以及嵌合抗原受体。

12.权利要求1-7任一所述的t细胞或权利要求11所述的嵌合抗原受体t细胞在制备预防或治疗自身免疫病、肿瘤、病毒感染性疾病、细菌感染性疾病、遗传疾病、传染性疾病或心血管疾病产品中的用途。

技术总结
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种T细胞及其制备方法和用途，所述T细胞中免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因经过碱基编辑，所述碱基编辑为利用碱基编辑系统对免疫检查点相关基因或编码免疫检查点相关基因特异性受体的基因的多核苷酸上的至少部分靶C碱基和/或靶A碱基脱氨基，以在基因编码区引入终止密码子或点突变起始密码子，或破坏可变剪切位点。本发明可以在克服CRISPR/Cas技术引起的DNA双链所造成的有害影响的前提下制备T细胞。

技术研发人员：英函,王骊灵
受保护的技术使用者：辑康科技（珠海）有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15