基于Real-timeMIRA技术检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和incA基因的引物探针组及其应用的制作方法

本发明涉及细菌检测，具体是基于real-time mira技术检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因的引物探针组及其应用。

背景技术：

1、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，kp)是一种条件性致病菌，当机体免疫力下降时常常可以引起呼吸系统、泌尿系统、血液系统、软组织等感染。在20世纪80年代中期，我国台湾地区首次报道了一种独特的社区获得性、组织侵袭性肺炎克雷伯菌感染的临床综合征，主要表现为化脓性肝脓肿，感染灶可出现在多个部位并可能发生转移性传播；该新发现的菌被命名为高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent klebsiella pneumoniae，hvkp)，hvkp能在相对健康的宿主造成严重的、潜在致命的感染，而经典肺炎克雷伯菌(classicklebsiella pneumoniae，ckp)倾向于感染免疫功能低下的人群。hvkp能造成如脑膜炎、坏死性筋膜炎、眼内炎和骨髓炎等原发感染，并且感染能力较ckp更强；其主要为毒力基因为peg344和inca。

2、目前，针对高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因peg344和inca检测的方法主要有传统pcr方法和real-time pcr方法，这些方法存在检测周期长、技术要求高、过程繁琐等不足。

3、多酶等温快速扩增(multienzyme isothermal rapid amplification，mira)是近几年开发的一种新的恒温扩增技术，反应温度通常为25-42℃，反应时间通常为15-20min，引物数量为2条，结果判读方式有琼脂糖凝胶电泳、实时荧光检测、胶体金试纸条。目前暂无采用real-time mira检测高毒力肺炎克雷伯菌的报道。中国专利公开了快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的检测方法及试剂盒(公告号cn111500751a)，该专利技术通过设计2对引物扩增高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因的6个不同区域，建立一种快速、简便、经济地检测痰液中高毒力肺炎克雷伯菌的方法。检测高毒力肺炎克雷伯菌的时间更短，可在2.5个小时内得到结果，但是其检测周期还是较长，精度不高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供基于real-time mira技术检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因的引物探针组及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、基于real-time mira技术检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因的引物探针组，包括引物和探针组，所述引物包括正向引物和反向引物，并分别用于扩增高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因；所述探针组分别用于检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因；

4、所述用于检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因的探针组的核苷酸序列为：

5、tcctttctctctaatgatttatggtgaggt[fam-dt]a[thf][bqh-dt]gtaaacc caggactt-[c3spacer]；

6、所述用于检测高毒力肺炎克雷伯菌inca基因的探针组的核苷酸序列为：

7、tggctaccgaccacctcttcccgctcgctc[vic-dt]a[thf][bhq-dt]gcgccacc agcagcg-[c3spacer。

8、作为本发明再进一步的方案：所述用于扩增高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因的：正向引物为peg344-f1、peg344-f2、peg344-f3中的一种，反向引物为peg344-r1、peg344-r2、peg344-r3中的一种；

9、其中，peg344-f1的核苷酸序列为ccctccagtctttgctaccgggatgagatt；

10、peg344-f2的核苷酸序列为tccgctcaattattaatcattatcgcatgg；

11、peg344-f3的核苷酸序列为tcctgttggccagcgtctatttcaacttgc；

12、peg344-r1的核苷酸序列为attagtccagtaatctgtattgagtttg；

13、peg344-r2的核苷酸序列为cctccgtgatgaggatgaacgaaagtgaag；

14、peg344-r3的核苷酸序列为aagaaagggcaataactcccgtccactgg。

15、作为本发明再进一步的方案：所述用于扩增高毒力肺炎克雷伯菌inca基因的：正向引物为inca-f1、inca-f2、inca-f3中的一种，反向引物inca-r1、inca-r2、inca-r3中的一种；

16、其中，inca-f1的核苷酸序列为atcaatggctattcccgctgcacccgtggc；

17、inca-f2的核苷酸序列为tctgttgcagcaggagtggtgccaggagct；

18、inca-f3的核苷酸序列为caatggctattcccgctgcacccgtggcag；

19、inca-r1的核苷酸序列为atcaatggctattcccgctgcacccgtggc；

20、inca-r2的核苷酸序列为ctttcactgacagggtacggacggagttgg；

21、inca-r3的核苷酸序列为acggagttggtcaggcgcacgctcagggag。

22、作为本发明再进一步的方案：所述正向引物和反向引物的核苷酸序列均为寡核苷酸序列。

23、作为本发明再进一步的方案：该引物探针组同时检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因的方法如下：

24、s1、配置反应体系：取溶解缓冲液29.4μl，10μm扩增高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因的正向引物和反向引物各1.0μl，10μm检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因的探针组各0.3μl，待测模板dna 2μl，无菌双蒸水11.5μl，共计47.5μl，配制成反应体系；

25、s2、在配置好的反应体系中加入50mg冻干酶粉，混匀，再加入2.5μl物质的量浓度为280mm的醋酸镁溶液于管盖中，离心分离，在40℃恒温下反应20min，进行real-time mira(实时荧光定量多酶等温快速扩增)扩增；

26、多酶等温快速扩增(multienzyme isothermal rapid amplification，mira)是一种等温扩增技术，主要依赖于重组酶、具有聚合链置换功能的dna聚合酶、单链结合蛋白3种核心蛋白实现对靶基因的等温扩增。在反应过程中，重组酶结合引物形成蛋白-dna混合物并启动寻找模板dna上的同源序列。同源序列定位后，则会引发链置换反应，引物结合到对应模板上，具有链置换功能的dna聚合酶进而从引物3’末端开始启动dna合成，实现对靶基因的指数级扩增；

27、real-time mira能够在37～42℃恒温条件下20min内完成对靶基因的有效扩增，特别适用于体外诊断、生物安全领域；

28、s3、采用荧光pcr仪观察检测结果。

29、基于real-time mira技术检测高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因的引物探针组的应用，用于实现高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因的快速准确检测。

30、与现有技术相比，本发明的有益效果：

31、本发明通过real-time mira技术对高毒力肺炎克雷伯菌peg344基因和inca基因进行快速筛查，其检测时间短，特异性强，灵敏度高，重复性好；可在第一时间提供诊治依据，提高感染的救治率，降低重症感染及继发重症感染的发病率和死亡率。