一种用于检测过氧化氢的化学发光探针及其制备方法和应用

本发明涉及化学分析检测，尤其涉及一种用于检测过氧化氢的化学发光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、过氧化氢是公认的活性氧和氮物种的前体，是氧代谢的重要产物，在免疫反应和细胞信号转导等许多生物过程中起着重要的作用。但是，过氧化氢的异常产生会破坏细胞生物分子，这与许多疾病密切相关。已知过氧化氢过量会导致氧化应激，氧化应激将导致大量植物生理化学过程以及各种疾病(例如癌症和神经退行性疾病)。因此，开发用于过氧化氢检测和定量测定的高灵敏性和选择性的荧光探针，对于监测过氧化氢的体内产生并阐明其生物学功能非常重要。内质网是细胞中最大的细胞器，它是细胞中蛋白质折叠和分解的重要场所，也是脂质的主要合成部位，内质网往往对细胞环境的变化有非常敏感的反应。因此，开发一种能够检测内质网上过氧化氢的探针非常有意义。

2、目前用于检测过氧化氢的方法主要有电化学法、比色法、质谱法、高效液相色谱法等，其普遍具有前处理复杂、破坏细胞组织结构、费用高昂等缺陷。近年来，荧光探针检测法因其高灵敏度、低毒性、操作简便等优势，受到科研工作者的青睐。目前采用荧光小分子检测过氧化氢的方法已经比较成熟。2019年caixiayin团队开发了一种检测过氧化氢的近红外检测器。2021年，tianyuliang团队成功开发了一种过氧化氢响应以及粘度响应的双锁钥双光子荧光探针，并将其应用在在细胞成像和炎症治疗中。但是目前用于过氧化氢检测的荧光探针存在很多局限性，通常包括：(1)荧光探针的光稳定性差，在连续光照下易漂白；(2)对过氧化氢的选择性不够高，检测结果容易受到其他ros的干扰；(3)一些荧光探针不能很好地避免生物背景荧光的干扰，导致检测精度差；(4)探针的荧光量子产率低，成像效果差；(5)合成路线比较复杂，导致检测试剂合成成本高，费事费力等。

3、内质网是一个复杂的细胞器，其中过氧化氢可以在不同的亚区域产生。内质网中的过氧化氢含量通常较低，因此对其进行检测需要具备高灵敏度的技术。然而，目前的技术在检测内质网中微量过氧化氢时存在一定的挑战。常规的检测方法可能无法满足对低浓度过氧化氢的敏感检测要求，从而影响了对内质网过氧化氢含量的准确测量。由于对内质网中过氧化氢含量的检测是一个具有一定挑战性的任务。目前存在的技术在这方面确实存在一些局限性，包括定位精确度低和灵敏度差的问题。化学发光作为小分子荧光探针的一类，近些年其设计与应用也备受关注，但目前还没有关于能够靶向检测细胞内质网中过氧化氢的化学发光探针被报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种用于检测过氧化氢的化学发光探针及其制备方法，并将其应用于过氧化氢的检测中，以克服现有技术中对内质网中过氧化氢含量的检测存在定位精确度低、灵敏度差的问题。

2、为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本技术首先提供了一种用于检测过氧化氢的化学发光探针，该探针具有如式(ⅰ)所示的结构式，

4、(ⅰ)

5、1,2-二氧杂环丁烷类的化学发光探针是当下最热门的荧光探针之一，它具有无需外源光激发的特点，使其与传统荧光探针相比有着背景光低、荧光持续时间长、对底物的检测更加便捷等优势。对甲苯磺酰胺是一种常见的内质网靶向基团，被用于传统荧光探针结构的构建，该靶向基团被诸多文献应用，证明其具有内质网靶向的高效性和专一性。化学发光探针与荧光探针是两种不同类型的探针，迄今为止，靶向内质网的化学发光探针仍然未见报道。考虑到无需外源光激发即可对体内内质网进行实时成像的必要性，申请人首次将内质网靶向基团应用到化学发光探针上，并成功构建出如式(ⅰ)所示的化合物探针。该探针由内质网靶向基——对甲苯磺酰胺以及化学发光屏蔽器——频哪硼酸醇酯构成，能够被过氧化氢响应，并成功的在细胞的内质网中检测到探针的荧光。

6、如式(ⅰ)所示的化合物的作用机制为：硼酸酯结构被过氧化氢氧化后，发生1,6消旋，羟基去质子化，如式(ⅰ)所示的化合物进入不稳定的高能态，随后分子发生解离，化学发光被开启。

7、第二方面，本技术提供了一种用于制备以上所述的用于检测过氧化氢的化学发光探针的方法，包括以下步骤：

8、(1)将如式(ⅱ)所示的化合物溶于溶剂中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基苯并三唑酮、n-甲苯磺酰基乙二胺、n,n-二异丙基乙胺进行反应，反应结束后，分离纯化得到如式(ⅲ)所示的化合物；

9、(2)将如式(ⅲ)所示的化合物溶于溶剂中，加入碱、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，在惰性气体的气氛中进行反应，反应结束后，分离纯化得到如式(ⅳ)所示的化合物；

10、(3)将如式(ⅳ)所示的化合物溶于溶剂中，加入的亚甲基蓝并通入氧气，光照反应结束后，分离纯化得到如式(ⅰ)所示的化合物；

11、(ⅰ)(ⅱ)(ⅲ)(ⅳ)

12、本发明中的如式(ⅱ)所示的化合物为已公开的化合物，其合成制备的方法可参考文献：green,o.,eilon,t.,hananya,n.,gutkin,s.,bauer,c.r.,&shabat,d.(2017).opening agateway for chemiluminescence cell imaging:distinctive methodologyfor design of bright chemiluminescent dioxetane probes.acs cent sci,3(4),349-358.。

13、为了获得效果更好的内质网靶向化合物，申请人对一系列已经被报道的内质网靶向基团化合物进行筛选，下面列举两款筛选过程中所合成的化合物；

14、化合物(a)：

15、

16、化合物(b)：

17、

18、在一系列筛选后，申请人设计的如式(ⅰ)所示的化合物所携带的内质网靶向基团——对甲基苯磺酰胺与其他靶向基团相比，其具有更高的内质网靶向性，灵敏度更高，响应性能更优越，因此确定如式(ⅰ)所示的化合物作为最终化合物。

19、作为优选，所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲苯、四氢呋喃、二甲基甲酰胺中的一种或多种。

20、作为优选，所述步骤(1)中的如式(ⅱ)所示的化合物、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基苯并三唑酮、n-甲苯磺酰基乙二胺、n,n-二异丙基乙胺的物质的量之比为1:1.5～2.5:2.5～3.5:1:2.5～3.5。

21、进一步优选，所述步骤(1)中的如式(ⅱ)所示的化合物、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基苯并三唑酮、n-甲苯磺酰基乙二胺、n,n-二异丙基乙胺的物质的量之比为1：2：3：1：3。

22、作为优选，所述步骤(2)中的如式(ⅲ)所示的化合、碱、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的物质的量之比为1:3～4:1～1.5。

23、进一步优选，所述步骤(2)中的如式(ⅲ)所示的化合、碱、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的物质的量之比为1：3：1.2。

24、作为优选，所述步骤(2)中的碱为哌啶、三乙胺、碳酸钾、碳酸钠中的一种或多种。

25、作为优选，所述步骤(3)中的惰性气体为氮气。

26、作为优选，所述步骤(3)中的如式(ⅳ)所示的化合物和亚甲基蓝的物质的量之比为1:0.2～0.3。

27、进一步优选，所述步骤(3)中的如式(ⅳ)所示的化合物和亚甲基蓝的物质的量之比为1：0.3。

28、进一步优选，所述步骤(1)中的反应条件为室温反应1-3h，所述步骤(2)中反应3-6h，所述步骤(3)中光照反应30-60min。

29、进一步优选，所述步骤(1)和(2)中的分离纯化步骤具体为：将反应结束后得到的反应液经乙酸乙酯萃取，取有机相进行减压浓缩，用体积比为1：1的石油醚与乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂进行柱层析纯化，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩，得到纯化后的反应产物；所述步骤(3)中的分离纯化步骤具体为：将反应结束后得到的反应液经二氯甲烷萃取，取有机相进行减压浓缩，用体积比为1：1的石油醚与乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂进行柱层析纯化，收集含目标产物的洗脱液，减压浓缩，得到纯化后的反应产物。

30、第三方面，本技术提供了以上所述的用于检测过氧化氢的化学发光探针或者所述的制备方法所制备得到的化学发光探针在过氧化氢检测中的应用。

31、进一步优选，所述化学发光探针在靶向检测细胞内质网中过氧化氢的含量中的应用。

32、本发明具有以下有益效果：

33、(1)本发明首次将内质网靶向基团应用到化学发光探针上，不仅赋予化学发光探针具有内质网靶向性，而且在靶向内质网的同时能够对过氧化氢进行响应激发出550nm的荧光发射；

34、(2)由于如式(ⅰ)所示的化学发光探针无需外源光激发，因此具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小等优点；

35、(3)如式(ⅰ)所示的化合物对过氧化氢敏感性高，在靶向内质网的同时具有较高的过氧化氢敏感性，对过氧化氢的检测下限为126nm，能够检测126nm-98μm浓度的过氧化氢，其在126nm-98μm过氧化氢浓度范围内与其荧光强度成正比；

36、(4)本发明所提出的如式(ⅰ)所示的化合物能够为研究细胞内质网中过氧化氢的含量提供一种有效的研究工具，可为临床诊断领域提供早期预警。