一种高效生产胞苷酸的方法及应用与流程

本发明涉及一种高效生产胞苷酸的方法及应用，属于生物。

背景技术：

1、胞苷5’-单磷酸(简称5’-cmp)属于胞嘧啶核苷酸的一种，是rna的结构成分之一。5’-cmp应用于不同的领域，它可作为药物合成的前体或中间体应用于医药领域，也可作为食品营养强化剂应用于食品领域，是一种重要的核苷酸。在食品领域，5’-cmp是一种重要的增鲜剂，可以添加到味精等调味品中，提高食品的鲜味，在节约粮食方面具有重大意义；在医药领域，5’-cmp在生物医药行业中是合成核苷酸药物的关键中间体，在核苷酸药物中，例如三磷酸胞苷、胞嘧啶β-d-呋喃阿拉伯糖苷、二磷酸胞嘧啶胆碱和聚肌苷酸-聚胞苷酸等的生产都需要5’-cmp作中间体。在人体和哺乳动物的免疫系统中，5’-cmp发挥重要作用。研究表明，添加5’-cmp的婴幼儿奶粉的功效更接近母乳，与未添加5’-cmp婴幼儿奶粉相比，能够明显提高婴幼儿的免疫力。

2、目前，生产5’-cmp的方法主要包括：酵母核酸水解法、化学合成法、酶合成法和生物发酵法。酵母核酸水解法传统方法利用rna制备5’-cmp，包括核酸化学水解法和利用核酸水解酶水解法。常用的核酸水解酶是5’-磷酸二酯酶，利用5’-磷酸二酯酶(5’-pde)水解酵母rna制备风味核苷酸和其他具有医用价值的核苷酸，再经离子交换法分离获得相应的核苷单磷酸盐。化学水解法是将酵母rna在强酸溶液(硫酸或硝酸)中脱氨制备胞苷酸或尿苷酸。核酸水解法在原材料来源和反应条件等方面具有较大优势，但该方法存在反应时间长，水解后得到的四种核苷酸混合物分离工序复杂，且成本高等问题。化学合成法主要是利用甲基化的核苷与磷酸或者焦磷酸发生磷酸化反应，如利用2’,3’-异丙基亚甲基核苷与磷酰氯发生磷酸化反应，合成5’-核苷酸，在反应前加入少量水，可大大提高核苷酸的产率。另外，用三烷基磷酸酯替代磷酰氯，和核苷发生磷酸化反应也可以获得相应的核苷酸产物。化学合成法所需试剂成本高，反应后的废水对环境存在污染。尿苷-胞苷激酶是生物体嘧啶核苷酸代谢补救途径中的重要催化剂，它可以使胞苷/尿苷磷酸化生成5’-cmp，但需要ntp为该反应提供磷酸基团。已报道的在大肠杆菌(escherichia coli)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)中尿苷和胞苷进行磷酸化反应时，需要gtp为该反应提供磷酸基团，但是gtp的采购成本过高。

3、生物发酵法是依靠微生物的发酵作用合成所需要的物质，微生物发酵法合成具有条件简单、生长周期短、生产产品成本高、发酵条件易于控制、产量高、生产原料成本低等优点，适合大规模工业化生产。前期调研中，关于5’-cmp下游代谢产物胞苷的微生物生产方面的研究较多，但对于5’-cmp的微生物生产研究较少。微生物中有两种途径来合成单磷酸胞苷，从头合成途径和嘧啶补救途径。嘧啶补救途径是细胞直接从外部环境吸收胞嘧啶或者脱氧胞苷三磷酸经转化得到胞苷，胞苷再经尿苷胞苷激酶生成5’-cmp。5’-cmp从头合成途径是以谷氨酰胺、碳酸和atp为原料，在一系列酶的作用下，经过一系列反应，生成ump。在嘧啶核苷酸代谢途径中，ump是合成所有嘧啶核苷酸的前体物质，经过一系列胺化水解反应最终合成5’-cmp。在野生菌株中，5’-cmp的积累量非常低，这是因为5’-cmp属于嘧啶核苷酸代谢产物，嘧啶核苷酸代谢还包括ump、utp、ctp、cdp等，这些物质均是dna或rna的组成物质，具有复杂的调控机制。随着微生物学技术的发展，微生物的嘧啶核苷酸代谢机制逐渐清晰，利用微生物从头合成尿苷和胞苷的研究逐渐增多，清晰的代谢路径以及调控机制为研究微生物通过代谢工程生产5’-cmp提供了理论依据。

4、cn 111269870 a披露了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用，从胞苷酸生产菌株中克隆得到的胞苷激酶基因，重组菌经破碎后得到的粗酶液有着良好的催化活性和稳定性，加入胞苷、三磷酸腺苷(atp)以及mg2+，反应得到胞苷酸。但，该方法需要对重组菌进行破碎、再对酶进行分离，且产量不高。cn 202111280840.4披露了一种生产5’-胞苷酸的方法，基因敲除技术对大肠杆菌的胞苷单磷酸焦磷酸化酶基因usha和核苷酸5'-单磷酸核苷酶基因ppnn进行敲除，并通过过量表达尿苷激酶基因udk，获得可积累5’-胞苷酸(5’-cmp)的大肠杆菌突变体。但，上述重组菌株积累5’-cmp时需要诱导剂iptg和抗生素的补加，该诱导剂和抗生素价格昂贵且对细胞有毒性，同时如果5’-胞苷酸(5’-cmp)的积累浓度进一步获得提高，将进一步促进其工业化生产。

5、因此，目前研究目标在于利用代谢工程和合成生物学手段对e.coli出发菌株进行改造，以实现胞苷酸的高效生产。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本发明要解决的技术问题是现有技术中缺少能够高产5’-胞苷酸的重组菌株。

3、[技术方案]

4、本发明采用基因整合技术在大肠杆菌基因组上整合枯草芽孢杆菌的嘧啶操纵子pyr_bs，在大肠杆菌中重构ump合成途径，提高5’-cmp的合成途径的代谢通量，增强5’-胞苷酸的合成通量，可以高效生产5’-胞苷酸(5’-cmp)，促进其在医药等领域中的应用。

5、本发明提供了一种生产胞苷酸的重组大肠杆菌，在出发菌株中过表达天门冬氨酸氨基甲酰转移酶pyrb、二氢乳清酸酶pyrc、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合成酶pyraa、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合成酶pyrab-e949、二氢乳清酸脱氢酶基因pyrk、二氢乳清酸脱氢酶基因pyrd、乳清苷酸脱羧酶基因pyrf和乳清酸磷酸核糖基转移酶基因pyre，所述嘧啶特异性氨甲酰磷酸合成酶pyrab-e949是在pyrab的基础上，缺失第949位谷氨酸得到的。

6、在一种实施方式中，在出发菌株的基因组上整合枯草芽孢杆菌的嘧啶操纵子pyr_bs，所述嘧啶操纵子pyr_bs的基因簇顺序为pyrb、pyrc、pyraa、pyrab-e949、pyrk、pyrd、pyrf和pyre；所述pyrb的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述pyrc的核苷酸序列如seq idno.2所示，所述pyraa的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述pyrab-e949的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述pyrk的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述pyrd的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述pyrf的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述pyre的核苷酸序列如seq id no.8所示。

7、在一种实施方式中，所述嘧啶操纵子pyr_bs的整合位点为基因yghx或pta。

8、在一种实施方式中，所述出发菌株为e.coli cmp12或e.coli cmp13。

9、在一种实施方式中，所述e.coli cmp12及其构建方法已公开于专利cn116463273a，所述e.coli cmp12以e.coli mg1655为底盘细胞，敲除了基因组上的核苷酸5'-单磷酸核苷酶基因ppnn，胞苷单磷酸焦磷酸化酶基因usha、嘌呤核苷酸酶基因yrfg、嘧啶5’-核苷酸酶基因yjjg、ump磷酸酶基因umph、5’-核苷酸酶基因umpg和胞苷脱氨酶基因cdd；

10、在一种实施方式中，在umph位点整合5’-ctp二磷酸水解酶基因nudg；所述基因nudg的核苷酸序列如seq id no.20所示；在umpg位点整合乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyre，所述基因pyre的核苷酸序列如seq id no.15所示；

11、在一种实施方式中，还整合表达尿苷-胞苷激酶基因udk、磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd，所述基因udk的核苷酸序列如seq id no.16所示，所述基因prs的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述基因zwf的核苷酸序列如seq id no.18所示，所述基因gnd的核苷酸序列如seq id no.17所示。

12、在一种实施方式中，在所述出发菌株poxb位点整合基因pyrh(r92g/d93g)或pyrh(d93a)；所述基因pyrh(r92g/d93g)的核苷酸序列如seq id no.21所示，所述基因pyrh(d93a)的核苷酸序列如seq id no.22所示。

13、在一种实施方式中，所述基因ppnn的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述基因usha的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述基因yrfg的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述基因yjjg的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述基因umph的核苷酸序列如seqid no.13所示，所述基因umpg的核苷酸序列如seq id no.14所示；所述基因cdd的核苷酸序列如seq id no.23所示。

14、在一种实施方式中，e.coli cmp12-m4为以e.coli mg1655为出发菌株，分别敲除7个基因ppnn、usha、yrfg、yjjg、umph、umpg、cdd、yghx，同时过表达基因nudg、pyre、pyrh(r92g/d93g)、udk、ppp。

15、在一种实施方式中，e.coli cmp12-b4为以e.coli mg1655为出发菌株，分别敲除7个基因ppnn、usha、yrfg、yjjg、umph、umpg、cdd、pta，同时过表达基因nudg、pyre、pyrh(r92g/d93g)、udk、ppp。

16、在一种实施方式中，e.coli cmp13-m4为以e.coli mg1655为出发菌株，分别敲除7个基因ppnn、usha、yrfg、yjjg、umph、umpg、cdd、yghx，同时过表达基因nudg、pyre、pyrh(d93a)、udk、ppp。

17、在一种实施方式中，e.coli cmp13-b4为以e.coli mg1655为出发菌株，分别敲除7个基因ppnn、usha、yrfg、yjjg、umph、umpg、cdd、pta，同时过表达基因nudg、pyre、pyrh(d93a)、udk、ppp。

18、本发明还提供了一种发酵生产5’-胞苷酸的方法，是将所述重组大肠杆菌在含葡萄糖的培养基中发酵。

19、在一种实施方式中，发酵过程不添加任何抗生素和诱导剂(tptg)。

20、在一种实施方式中，所述发酵是将菌株接种至lb培养基中，37℃和200rpm，培养6-16h；对于摇瓶发酵，按照0.2-10％接种量接种至含有30-100ml lb培养基的250ml三角瓶中，37℃和200rpm，培养50-80h。

21、在一种实施方式中，所述发酵是将lb培养基中的种子液按照1-12％接种量，转接至发酵培养基中，在37℃和200rpm条件下进行发酵培养，通过测定发酵液中葡萄糖控制葡萄糖浓度为10±2g/l；控制溶氧为30％，当溶氧低于30％，提高搅拌转速、通气量和罐压。采用氨水控制ph为6-8。

22、在一种实施方式中，用于发酵的发酵培养基含有：葡萄糖20-70g/l、氯化铁2-15mg/l、mgso4 0.1-3g/l、柠檬酸钠1-20mg/l、氯化钙10-500mg/l、磷酸氢二钠1-6g/l、磷酸二氢钠1-9g/l、氯化锌1-60mg/l、酵母粉0.5-12g/l、蛋白胨0.2-15g/l、微量元素1-30ml(含有氯化铜2-51g/l、硫酸锌3-28g/l、钼酸钠3-50g/l)。

23、在一种实施方式中，发酵过程还进行补料；所述补料培养基含有：葡萄糖400-800g/l、蛋白胨1-16g/l、酵母粉1-15g/l。

24、本发明还提供了所述重组大肠杆菌在医药领域生产含5’-胞苷酸的产品中的应用。

25、有益效果

26、本发明通过整合枯草芽孢杆菌的嘧啶操纵子基因簇pyr_bs，在大肠杆菌中重构ump合成途径，提高5’-胞苷酸合成途径的代谢通量，实现高效生产5’-胞苷酸(5’-cmp)。在60l发酵罐中发酵60h的产量达到49g/l，基本不积累中间代谢产物，有利于5’-胞苷酸的分离纯化。

27、本发明提供的重组大肠杆菌，能够以葡萄糖为底物，在不补加诱导剂iptg和抗生素的条件下，一步发酵得到5’-胞苷酸，发酵上清液中5’-胞苷酸浓度高，便于分离纯化，工艺简单。