Claudin18.2特异性分子影像探针及其制备方法和应用

本发明涉及分子影像探针，具体涉及一种claudin18.2特异性分子影像探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤中的第二位，死亡率仅次于肝癌和肺癌。手术为最常见的治疗方法，但多数患者确诊时已处于晚期，整体预后不佳。进展期胃癌一线治疗方式为化疗，随着肿瘤耐药性的增加，患者无法获得较好的远期生存。在肿瘤诊疗策略中，分子靶向治疗如小分子抑制剂和单克隆抗体以及免疫治疗(如免疫检查点抑制剂)等正在改变多种实体肿瘤及血液系统肿瘤的治疗现状。寻找合适的胃癌诊疗靶点对于胃癌患者群体获益具有重要意义。

2、紧密连接蛋白18(claudin18,cldn18)是位于上皮和内皮的紧密连接中的跨膜蛋白，是构成细胞间紧密连接重要的组成及功能结构。人类cldn18基因第一个外显子存在两个等位基因，其差异形成了两种不同的剪切突变体，分别是cldn18.1蛋白和cldn18.2蛋白。cldn18在正常组织中高度保守，cldn18.2蛋白主要分布于分化周期短、更新速度快的胃黏膜(胃正常腺体、主细胞、壁细胞、内分泌细胞)，以及十二指肠的潘氏细胞内。目前普遍认为肿瘤在恶性转化中细胞极性发生改变，导致cldn18.2广泛分布于细胞膜表面。胃癌中cldn18.2阳性率，以及cldn18.2阳性胃癌在胃癌中占比，在不同研究中存在较大差异，目前的部分研究将胃癌cldn18.2表达率限定42％～86％，cldn18.2阳性胃癌约占胃癌人群中的16％～73％，cldn18.2表达具备一定的分子病理特点：弥漫型胃癌高于肠型胃癌，ebv病毒(epstein-barr virus)阳性胃癌高于阴性胃癌(81.0％vs.40.2％，p<0.001)，原发灶、周围淋巴结转移以及远处转移病灶表达基本一致。由于在消化系统恶性肿瘤中的异常激活且高表达，cldn18.2被认为是消化系统恶性肿瘤治疗中的一个极具潜力的靶点。

3、已有研究表明cldn18.2是实体瘤治疗的良好靶点。zolbetuximab(imab362，claudixmab)是嵌合的igg1单克隆抗体，在肿瘤细胞表面与cldn18.2特异结合，从而引发抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,adcc)、补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity,cdc)，凋亡和抑制细胞增殖。目前多个i/ii期试验评估了其临床疗效和安全性。2022年11月17日安斯泰来公司(astellas)宣布claudin18.2抗体zolbetuximab+化疗联合治疗claudin18.2阳性、her2阴性的复发性转移性胃癌的三期临床spotlight达到主要终点。研究结果显示与安慰剂+mfolfox6相比，zolbetuximab+mfolfox6治疗的患者的无进展生存期(pfs)及总生存期(os)具有统计学意义。人源化抗cldn18.2自体car-t疗法也显示了抗肿瘤活性和安全性，正在进行的多项临床试验也有望为cldn18.2阳性肿瘤患者提供更多选择。cldn18.2涉及靶向药、小分子抑制剂、以及car-t、免疫细胞治疗、抗体耦联药、肿瘤疫苗等，癌种涉及胃癌，胃-食管交界部癌以及胰腺癌，cldn18.2的个体化免疫治疗或将是下一个消化系统恶性肿瘤研究的热点。

4、抗体因其明确的结构、相对的稳定性、高特异性和高亲和力在生物医学研究中受到特别关注。基于抗体构建的探针所开展的pet显像被称之为免疫pet显像，属于分子影像的一个分支，采用靶向肿瘤细胞及肿瘤微环境受体的探针，可以实时有效地反映肿瘤发生发展。基于单克隆抗体构建的免疫pet探针具有稳定性高、特异性强的特点，临床应用相对广泛，但单克隆抗体(约150kd)分子量过大，组织渗透能力低，显像靶本比较差，非靶器官易产生非特异性摄取。单抗空间结构复杂，表达制备成本较高，具有很高的免疫原性，而改造的抗体很难达到原来的亲和力。诸多因素限制其在临床中的应用及普及。

5、纳米抗体来源于成年骆驼体内重链抗体的最小的功能性抗原结合片段，分子量仅为15kda。纳米抗体具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，和常规抗体相比具有许多独特的性质：1)纳米抗体编码的序列与人vh家族3和4同源性高，免疫原性弱；2)纳米抗体分子量小，结构简单，可在微生物体系中大量表达，易于纯化；3)纳米抗体可以识别大量的抗原表位，包括一些藏在分子裂缝中的表位都能识别；4)由于分子量小，使得它们易于穿透组织，到达常规抗体难以到达的部位；5)可与短半衰期核素匹配，实现当日显像。纳米抗体的种种特性使其成为很有前途的疾病诊断和治疗工具：作为显像示踪剂，纳米抗体可以及早获取高质量图像；作为治疗剂，纳米抗体可以通过与细胞毒性药物偶联，通过特异性传送至靶点实现精准的靶向治疗。近年来，我们专注于纳米抗体衍生示踪剂的开发和临床转化，以发挥其优越的分子成像特性。虽然放射性标记的单价纳米抗体是理想的伴随诊断工具，但体内半衰期太短，肾脏摄取高，使其仍存有进一步改进的空间。为了开发一个集成的诊断治疗平台，将靶向人/鼠白蛋白的白蛋白结合域(abd)引入纳米体以延长纳米抗体衍生物在体内的半衰期。研究表明，同时靶向肿瘤抗原和白蛋白双特异性纳米抗体衍生物，改善了体内生物分布情况，可以作为开发治疗诊断学工具箱的载体。

6、因此，本领域的技术人员致力于开发一种制备成本低廉、分子量小、体内循环时间短、显像周期短、辐射剂量低、易于临床转化应用的纳米抗体免疫pet显像探针。

7、此外，传统筛选cldn18.2阳性患者群体依赖于活检或手术标本的病理结果，创伤性较大、可重复性差，且由于取样的误差及肿瘤的异质性可能导致染色结果的差异。常用的claudetecttm18.2免疫组化试剂盒无法区分cldn18的两种剪切突变体，可能存在假阳性结果。常用的非特异性显像剂18f-fdg pet/ct在胃癌远处转移即m分期方面的价值已经得到公认,而在原发肿瘤和局部淋巴结的诊断、评价方面与比其他影像方法并无令人信服的优势,尤其是对早期胃癌、印戒细胞癌或粘液腺癌的诊断价值差强人意。目前亟需能无创早期诊断胃癌及筛选合适的靶向治疗患者群体的工具。

8、分子影像学在协助进行疾病筛查、鉴别诊断、患者分层及临床分期、疗效评估及预后方面发挥着不可忽视的作用。开发新型探针实现胃癌特异性靶点无创可视化对于早期诊断和精准治疗对降低胃癌患者死亡率和延长生存期至关重要。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明的目的在于，提供一种claudin18.2特异性分子影像探针及其制备方法和应用。本发明通过构建新型claudin 18.2(cldn18.2)特异性分子影像探针，实现恶性肿瘤细胞表面cldn18.2的无创可视化，在体监测表达水平差异及动态演变，在此基础上进一步提高探针的效能，推进实现诊疗一体化。

2、基于现有证据和申请人之前的发现，我们假设靶向cldn18.2的免疫pet显像探针可以无创地显示胃癌肿瘤细胞cldn18.2表达，服务于胃癌系统的诊疗体系，推进精准医学个体化治疗的发展。

3、已有研究表明免疫pet相较于免疫组织化学染色或其他传统预测标志物可以更好的显示体内感兴趣靶点的分布情况及分布丰度，并更好的预测对于靶向治疗的应答反应。传统的基于单克隆抗体构建的免疫pet探针具有稳定性高、特异性强的特点，临床应用相对广泛，但单克隆抗体(约150kda)分子量过大，组织渗透能力低，显像靶本比较差，非靶器官易产生非特异性摄取。单抗空间结构复杂，表达制备成本较高，具有很高的免疫原性，而改造的抗体很难达到原来的亲和力。诸多因素限制其在临床中的应用及普及。目前cldn18.2分子影像探针领域尚处于待开发阶段。

4、为了填补该领域的空白，申请人创新开发了一种由纳米抗体衍生的cldn18.2靶向诊疗对的构建，并表征了其在细胞衍生异种移植(cdx)和患者衍生异种移植(pdx)模型中的诊断及潜在治疗价值。

5、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

6、第一方面，本发明提供了一系列cldn18.2特异性纳米抗体，所述纳米抗体为hu19v3、3e10、3e11、3a12，具有如seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7所示的氨基酸序列。

7、优选地，所述hu19v3、3e10、3e11、3a12具有如seq id no.2、seq id no.4、seq idno.6、seq id no.8所示的基因序列。

8、第二方面，本发明提供了一种根据纳米抗体在制备cldn18.2特异性纳米抗体融合蛋白中的应用。

9、所述纳米抗体融合蛋白通过含有不同氨基酸长度的ggggs连接子，桥接血清蛋白结合域(abd)及纳米抗体(hu19v3)而组成，所述连接子“ggggs”为1-10组，具体可为1组、2组、3组、4组、5组、6组、7组、8组、9组或10组。

10、优选地，所述连接子为3组，具有ggggsggggsggggs所示的氨基酸序列。

11、第三方面，本发明提供了一种cldn18.2特异性纳米抗体融合蛋白，所述cldn18.2特异性纳米抗体融合蛋白为abdcldn18.2；

12、所述abdcldn18.2具有如seq id no.9所示的氨基酸序列。

13、优选地，所述abdcldn18.2具有如seq id no.10所示的的基因序列。

14、本发明所述的cldn18.2特异性纳米抗体或cldn18.2特异性纳米抗体融合蛋白的制备方法为：将cldn18.2特异性纳米抗体或cldn18.2特异性纳米抗体融合蛋白的基因序列(如seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10所示)克隆到表达载体上；再将所述基因序列转化到表达宿主的菌株里，将转化后的菌株扩大培养、诱导表达，纯化后即得到所述cldn18.2特异性纳米抗体或cldn18.2特异性纳米抗体融合蛋白。

15、第四方面，本发明提供了一种根据纳米抗体或纳米抗体融合蛋白在制备cldn18.2特异性分子影像探针中的应用。

16、第五方面，本发明提供了一种cldn18.2特异性分子影像探针，所述探针包括肿瘤靶向基团和放射性核素；

17、所述肿瘤靶向基团选自cldn18.2特异性纳米抗体或cldn18.2特异性纳米抗体融合蛋白。

18、优选地，所述放射性核素选自68ga、64cu或89zr；

19、当所述放射性核素选自68ga、64cu或89zr时，所述探针还包括螯合剂，所述螯合剂选自p-scn-bn-nota、p-scn-bn-dota或p-scn-bn-deferoxamine。

20、优选地，所述探针为68ga标记单价纳米抗体探针[68ga]ga-nota-hu19v3、[68ga]ga-nota-3e10、[68ga]ga-nota-3e11、[68ga]ga-nota-3a12、68ga标记纳米抗体融合蛋白探针[68ga]ga-nota-abdcldn18.2、64cu标记纳米抗体探针[64cu]cu-dota-hu19v3、89zr标记纳米抗体融合蛋白探针[89zr]zr-dfo-abdcldn18.2中的任一种。

21、优选地，所述探针包含肿瘤靶向基因、螯合剂和放射性核素68ga、64cu或89zr时，其制备方法包括以下步骤：

22、将采用螯合剂对肿瘤靶向基因进行修饰，形成修饰后的纳米抗体；然后采用放射性核素68ga、64cu或89zr对修饰后的纳米抗体进行标记，即得探针。

23、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

24、1)本发明构建的分子探针(如[68ga]ga-nota-hu19v3、[68ga]ga-nota-3e10、[68ga]ga-nota-3e11、[68ga]ga-nota-3a12、[64cu]cu-dota-hu19v3、[68ga]ga-nota-abdcldn18.2及[89zr]zr-dfo-abdcldn18.2)为正电子核素发射型探针，可用于免疫pet显像；通过开展基于上述探针的免疫pet显像，可实现cldn18.2在肿瘤组织及正常组织器官表达的无创可视化，进一步用于特定类型肿瘤的无创靶点特异性诊断。

25、2)本发明所构建的纳米抗体融合蛋白abdcldn18.2不仅在显像结果上优化了单价纳米抗体的药代动力学特性，其本身也作为抗体成药策略中的重要一环在肿瘤治疗方向彰显独特价值，临床意义显著。本发明构建的纳米抗体融合蛋白探针能够为cldn18.2阳性肿瘤提供更深入的诊断信息及定量分析，为抗体治疗提供有效手段及有力依据。

26、3)本发明实现了对cldn18.2表达水平的无创可视化和动态评估，进一步实现胃癌的在体诊断，设计的探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点。