抗人PD-L1鼠单抗及其制备方法和应用与流程

本发明属于抗体领域，具体涉及抗人pd-l1鼠单抗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)也称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，cd274)或b7同源体(b7homolog 1，b7-h1)，是人类体内的一种蛋白质，由cd274基因编码。pd-l1是大小为40kda的第一型跨膜蛋白，据信其在某些特殊情形(例如怀孕、组织移植、自体免疫疾病，以及诸如肝炎等某些疾病)下，与免疫系统的抑制有关。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性t细胞(cd8+tcell增生)。而细胞程序性死亡受体-1(pd-1)与pd-l1结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结cd8+t细胞的增生，而且pd-1还可以借由调节bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性t细胞的聚积。

2、pd-l1抗体属于免疫检测点抑制剂，是一种抗体类的肿瘤免疫药物。它的机制是增强体内免疫细胞t对肿瘤的识别，从而达到杀灭肿瘤的作用。在许多肿瘤环境中，肿瘤细胞高表达pd-l1分子，与肿瘤部位浸润t淋巴细胞表面的pd-1分子结合后，抑制t细胞活性，实现肿瘤的免疫逃避。而目前pd-1/pd-l1抑制剂均是检测pd-l1的表达。

3、免疫检查点抑制剂可以与pd-1或pd-l1结合，阻断肿瘤细胞对免疫功能的控制，保证t细胞等免疫细胞的功能，重拾t细胞对肿瘤的清除作用。因此，如果肿瘤细胞含有大量的pd-l1，肿瘤患者可能会获益于免疫检查点抑制剂的治疗。免疫疗法可增强患者的免疫系统以帮助其识别并抵抗肿瘤细胞，它往往比其他的治疗方法具有更少的副作用。

4、专利cn 107973854 b提供的pd-l1单克隆抗体能有效抑制局部肿瘤生长；阻断pd-1/pd-l1信号可以促进肿瘤抗原特异性t细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用；阻断肿瘤细胞上相关pd-l1信号可上调浸润cd8+t细胞ifnγ的分泌。专利cn 109627339 b公开了结合人pd-l1的抗体或其抗原结合部分，编码所述抗体或其抗原结合部分的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合部分的应用。

5、基于临床需求，研制出一种可以大量制备，亲和力和特异性更高的针对pd-l1蛋白的单克隆抗体对诊断和治疗肿瘤疾病特具有重要的生物学和医学意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了抗人pd-l1抗体的具体氨基酸序列，通过该序列可以利用现有技术获得表达抗人pd-l1抗体的基因工程细胞，提高了pd-l1抗体的产率和生产稳定性，并且该抗体亲和力高，特异性强，有望用于制备抗肿瘤、免疫系统和神经系统疾病的诊断和治疗药物。

2、术语：

3、本发明中，cdr(complementarity-determining regions，cdr)叫做互补决定区或互补决定簇。它位于免疫球蛋白的超变区，超变区是抗体的抗原结合位，与抗原决定簇的结构互补。一般包括cdr1、cdr2、cdr3。

4、本发明中，可变区指免疫球蛋白轻链和重链靠近n端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。

5、本发明中，重链指抗体中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(h链)；轻链指抗体中2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(l链)。

6、本发明中，相似性指同源蛋白质的氨基酸序列中一致性和可取代氨基酸所占的比例。

7、本发明中，单克隆抗体指由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。

8、本发明中，鼠源化抗体指将来源于免疫接种过的小鼠的b细胞与骨髓瘤细胞融合，得到的鼠杂交融合细胞分泌的抗体。

9、一方面，本发明提供了抗人pd-l1抗体，所述的抗人pd-l1抗体包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区，所述的轻链包括轻链可变区；所述的重链可变区包括hcdr1、hcdr2、hcdr3，所述的轻链可变区包括lcdr1、lcdr2、lcdr3，其中：

10、(1)hcdr1为seq id no.1所示的氨基酸序列，或seq id no.2所示的氨基酸序列；

11、(2)hcdr2为seq id no.3所示的氨基酸序列，或seq id no.4所示的氨基酸序列；

12、(3)hcdr3为seq id no.5所示的氨基酸序列，或seq id no.6所示的氨基酸序列；

13、(4)lcdr1为seq id no.7所示的氨基酸序列，或seq id no.8所示的氨基酸序列；

14、(5)lcdr2为seq id no.9所示的氨基酸序列，或seq id no.10所示的氨基酸序列；

15、(6)lcdr3为seq id no.11所示的氨基酸序列，或seq id no.12所示的氨基酸序列。

16、具体地，所述的抗人pd-l1抗体重链可变区的氨基酸序列为seq id no.13或与seqid no.13具有80％以上序列相似性的序列；

17、或所述的抗人pd-l1抗体重链可变区的氨基酸序列为seq id no.14或与seq idno.14具有80％以上序列相似性的序列；

18、所述的抗人pd-l1抗体轻链可变区的氨基酸为seq id no.15或与seq id no.15具有80％以上序列相似性的序列；

19、或所述的抗人pd-l1抗体轻链可变区的氨基酸为seq id no.16或与seq id no.16具有80％以上序列相似性的序列。

20、优选地，所述的抗人pd-l1抗体重链可变区氨基酸序列为seq id no.13或seq idno.14；轻链可变区氨基酸序列为seq id no.15或seq id no.16。

21、具体地，所述的抗人pd-l1抗体重链氨基酸序列为seq id no.17，或与seq idno.17具有65％以上序列相似性的序列；

22、或所述的抗人pd-l1抗体重链氨基酸序列为seq id no.18，或与seq id no.18具有65％以上序列相似性的序列；

23、所述的抗人pd-l1抗体轻链氨基酸序列为seq id no.19，或与seq id no.19具有65％以上序列相似性的序列；

24、或所述的抗人pd-l1抗体轻链氨基酸序列为seq id no.20，或与seq id no.20具有65％以上序列相似性的序列。

25、优选地，所述的抗人pd-l1抗体重链氨基酸序列为seq id no.17或seq id no.18，轻链氨基酸序列为seq id no.19或seq id no.20。

26、具体地，所述的抗人pd-l1抗体为单克隆抗体；优选为鼠源化抗体。

27、另一方面，本发明提供了表达前述的抗人pd-l1抗体的核苷酸序列。

28、所述的核苷酸序列可以是通过密码子简并性优化后的序列，用于编码前述的抗人pd-l1抗体均可。

29、优选地，重链seq id no.17和seq id no.18对应的核苷酸序列分别为seq idno.21和seq id no.22，轻链seq id no.19和seq id no.20对应的核苷酸序列分别为seqid no.23和seq id no.24。

30、再一方面，本发明提供了包括前述的核苷酸序列的表达载体。

31、所述的表达载体可以是质粒、噬菌体、病毒。

32、又一方面，本发明提供了表达前述的抗人pd-l1抗体或核苷酸序列或表达载体的细胞。

33、所述的细胞的作用在于可以高效表达抗人pd-l1抗体。

34、具体地，所述的细胞可以是hek293或cho。

35、又一方面，本发明提供了制备前述的抗人pd-l1抗体的方法，所述的方法中包括培养前述的细胞。

36、所述的方法中还可能包括抗体纯化步骤。

37、所述的抗体纯化步骤可以是沉淀法、广谱亲和纯化、抗原特异性纯化、离子交换法。

38、又一方面，本发明提供了对前述的抗人pd-l1抗体进行荧光标记的方法，所述的方法中包括使用大分子染料对抗人pd-l1抗体进行标记。

39、优选地，所述的大分子染料为pe和apc。

40、又一方面，本发明提供了前述的抗人pd-l1抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞在pd-l1检测中的应用，所述的应用为非疾病诊断或治疗的应用。

41、所述的应用为通过抗体抗原结合实现。

42、所述的应用可以是检测t淋巴细胞中的pd-l1。

43、又一方面，本发明提供了前述的抗人pd-l1抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞在制备pd-l1检测试剂盒中的应用。

44、具体地，所述的试剂盒中还包括其他用于pd-l1检测的试剂，如：缓冲液、样品处理剂。

45、具体地，所述的试剂盒中还可以包括用于荧光标记抗体的分子。

46、进一步具体地，所述的分子可以是大分子染料优选地，所述的大分子染料为pe和apc。

47、又一方面，本发明提供了pd-l1检测方法，所述的检测方法通过前述的抗人pd-l1抗体进行检测。

48、具体地，所述的检测方法中还可以包括样品前处理步骤。

49、所述的前处理步骤为样本的采集及处理。

50、优选地，所述的检测方法非疾病诊断或治疗方法。

51、又一方面，本发明提供了一种pd-l1检测试剂盒，所述的试剂盒中包括前述的抗人pd-l1抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞。

52、具体地，所述的试剂盒中还包括其他用于pd-l1检测的试剂，如：缓冲液、样品处理剂。

53、具体地，所述的试剂盒中还可以包括用于荧光标记抗体的分子。

54、进一步具体地，所述的分子可以是大分子染料。

55、优选地，所述的大分子染料为pe和apc。

56、本发明的有益效果：

57、本发明提供了新的抗人pd-l1抗体，与pd-l1具有较好的结合能力和特异性，能够用于制备表达抗人pd-l1抗体的细胞，从而实现大量制备，为pd-l1的检测提供了更便利的条件。