一种亚细胞结构中RNA的检测方法

本发明涉及分子生物学，尤其是涉及一种亚细胞结构中rna的检测方法。

背景技术：

1、rna的亚细胞定位与其功能密切相关，不对称分布的rna是生物发育、局部蛋白质翻译和染色质结构的基础，rna在细胞内的位置可能决定其是否会被储存、加工、翻译和降解。因此，解析rna的亚细胞定位对其功能研究至关重要。

2、目前已经开发了许多方法来研究rna定位，但只有少数方法在转录组范围内得到了应用。其中最经典的方法是通过生化离心分层来获取各种细胞器，然后进行rna测序(“fractionation-seq”)，然而fractionation-seq的主要限制是它不能应用于无法纯化的细胞器，例如很多重要的亚细胞区域核纤层和线粒体外膜等，而且这种方法也导致引入很多杂质分子。另外，近年来出现的新型rna荧光原位杂交成像技术，虽然可以同时获取单细胞中上千种rna的空间信息，但这种基于荧光探针杂交的方案需要设计靶向感兴趣的rna的探针组，也并不能获得rna的全部序列信息，并且此技术需要昂贵复杂的自动化仪器，无法适用于大部分实验室。

3、因此，亟需一种无需昂贵仪器、适用范围广的rna定位检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服现有技术对检测对象要求高、检测结果受限、依赖高昂仪器等缺陷而提供一种亚细胞结构中rna的检测方法。通过使用特异性抗体靶向与rna相互作用的蛋白质和链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的t7-n9启动子结合捕获亚细胞定位的rna，以实现对亚细胞定位rna种类和功能的研究。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明的技术方案为提供一种亚细胞结构中rna的检测方法，包括如下步骤：

4、s1、将培养好的细胞依次进行固定、透化、封闭；

5、s2、将s1步骤封闭好的细胞、靶向于与待扩增rna相互作用的蛋白质的一抗进行混合孵育；

6、s3、将一抗洗涤缓冲液、链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的t7-n9启动子混合，得到二抗复合物；

7、s4、将s2步骤孵育后的细胞与s3步骤得到的二抗复合物进行混合孵育；

8、s5、将s4孵育后的细胞进行洗涤、逆转录得到mrna-cdna杂交体，并合成cdna第二条链；

9、s6、将s5得到的cdna第二条链进行体外转录，即得到扩增后的rna，将扩增得到的rna建库后进行测序，即可知细胞中与一抗靶向蛋白质相互作用的特异性rna及其分布。

10、在一些具体实施方式中，于s1步骤，培养好的细胞为细胞汇合度在70％～90％的细胞。

11、在一些具体实施方式中，于s2步骤，将靶向于与待扩增rna相互作用的蛋白质的一抗与细胞的比例为(0.6-0.7)μl:1×105个细胞。

12、在一些具体实施方式中，于s2步骤，孵育的温度为25℃，孵育的时间为2h，孵育的转速为70rpm。

13、在一些具体实施方式中，于s3步骤，二抗复合物的制备工艺为：将体积比为98.3:1:0.7的一抗洗涤缓冲液、12.5μm生物素化的t7-n9启动子、链霉亲和素偶联的二抗混合，在4℃孵育20min，再加入4倍总体积的一抗洗涤缓冲液，用蛋白质截留分子量为100kd的超滤管过滤，得到浓缩10倍体积的浓缩液，再加入与浓缩液同等体积的一抗洗涤缓冲液，即为二抗复合物。

14、在一些具体实施方式中，于s3步骤，生物素化t7-n9启动子的序列从5’端至3’端依次包括生物素标记、连接臂序列、t7启动子序列、缓冲序列、cdna接头的反向序列以及若干个随机碱基序列，所述连接臂序列用于增加生物素化t7-n9启动子的序列的灵活性，所述缓冲序列用于提高t7 rna聚合酶的转录效率，所述若干个随机碱基序列用于与rna随机配对。

15、优选的，于s3步骤，生物素化的t7-n9启动子中的序列如seq id no.1所示。

16、在一些具体实施方式中，于s4步骤，二抗复合物与细胞的比例为100μl:1×105个细胞。

17、在一些具体实施方式中，于s4步骤，孵育的温度为25℃，孵育的时间为大于等于45min，孵育的转速为70rpm。

18、在一些具体实施方式中，于s6步骤，利用t7 rna聚合酶进行体外转录。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、本发明为一种针对目标蛋白结合的转录本定点逆转录后进行扩增测序的技术(target transcript amplification and sequencing，tata-seq)，使用特异性抗体靶向与rna相互作用的蛋白质，然后定位逆转录产生rna/cdna杂交体，随后通过t7 rna聚合酶进行体外扩增后进行建库测序。抗体定位和t7 rna聚合酶体外扩增的高效性使得本发明特别适用于亚细胞区域rna定位的快速低成本研究，尤其是对揭示无膜细胞器中rna的定性和定量检测，有利于更深入地了解rna的生物功能。此外，本发明无需高端复杂仪器设备、昂贵实验试剂和高昂测序成本，本发明的成功研发，将为基础领域的科学家和临床领域的医生提供切实可用的先进工具。

技术特征：

1.一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s1步骤，培养好的细胞为细胞汇合度在70％～90％的细胞。

3.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s2步骤，将靶向于与待扩增rna相互作用的蛋白质的一抗与细胞的比例为(0.6-0.7)μl：1×105个细胞。

4.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s2步骤，孵育的温度为25℃，孵育的时间为2h，孵育的转速为70rpm。

5.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s3步骤，二抗复合物的制备工艺为：将体积比为98.3:1:0.7的一抗洗涤缓冲液、12.5μm生物素化的t7-n9启动子、链霉亲和素偶联的二抗混合，在4℃孵育20min，再加入4倍总体积的一抗洗涤缓冲液，用蛋白质截留分子量为100kd的超滤管过滤，得到浓缩10倍体积的浓缩液，再加入与浓缩液同等体积的一抗洗涤缓冲液，即为二抗复合物。

6.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s3步骤，生物素化t7-n9启动子的序列从5’端至3’端依次包括生物素标记、连接臂序列、t7启动子序列、缓冲序列、cdna接头的反向序列以及若干个随机碱基序列，所述连接臂序列用于增加生物素化t7-n9启动子的序列的灵活性，所述缓冲序列用于提高t7 rna聚合酶的转录效率，所述若干个随机碱基序列用于与rna随机配对。

7.根据权利要求6所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s3步骤，生物素化的t7-n9启动子中的序列如seq id no.1所示。

8.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s4步骤，二抗复合物与细胞的比例为100μl:1×105个细胞。

9.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s4步骤，孵育的温度为25℃，孵育的时间为大于等于45min，孵育的转速为70rpm。

10.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中rna的检测方法，其特征在于，于s6步骤，利用t7 rna聚合酶进行体外转录。

技术总结
本发明涉及一种亚细胞结构中RNA的检测方法，包括如下步骤：S1、将细胞依次进行固定、透化、封闭；S2、将封闭好的细胞、靶向于蛋白质的一抗混合孵育；S3、将一抗洗涤缓冲液、链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7‑N9启动子混合，得到二抗复合物；S4、将一抗孵育细胞与二抗复合物混合孵育；S5、将二抗孵育细胞进行洗涤、逆转录得到mRNA‑cDNA杂交体，并合成cDNA第二条链；S6、将cDNA第二条链进行体外转录，得到扩增的RNA，将RNA建库后进行测序，即可知细胞中与一抗靶向蛋白质相互作用的特异性RNA及分布。与现有技术相比，本发明无需高端仪器、昂贵试剂和高昂测序成本就能进行亚细胞的RNA定位。

技术研发人员：胡璐璐,蒋晓
受保护的技术使用者：复旦大学附属肿瘤医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16