一种利用小分子诱导多能干细胞向心肌细胞分化的方法与流程

本发明涉及干细胞生物，具体涉及bfgf、ra、xav939、activin a、chir99021、bmp4、fgf 10等小分子以及细胞因子在诱导epsc等多能性干细胞向心肌细胞分化中的应用。

背景技术：

1、根据世界卫生组织发布的《2022世界卫生统计报告》显示心脏病、痴呆和卒中仍是引起人类死亡的头号杀手。在中国，心脏病高发已成趋势，平均每5例死亡病例中就有2例死于心血管疾病。因心血管疾病具有高患病率、高致残率、高致死率的特点，即使应用最先进、完善的治疗手段，每年由于心肌梗死后心脏衰竭离世的病人仍高达740万。随着社会发展和科技进步，缺血性心脏病发病率日益增高，且病例趋于年轻化，引起人们的高度重视。目前，治疗心肌坏死性疾病的有效途径主要是心脏移植手术。但是由于心脏移植这一治疗途径存在供体短缺、器官适配性低、免疫反应复杂等缺点，使得临床上大部分病患不能得到心脏移植手术的治疗。为此，临床和实验研究都企图为心肌坏死性心脏病找寻一个新的治疗方案。

2、目前已有研究证实干细胞移植可改善心肌梗塞动物模型的心脏功能，分化而来的心肌细胞能够参与整个心脏协同跳动，能有效改善心功能，为心脏病治疗提供了一个新思路。

3、猪作为中国最常见的经济动物，来源充足，品种多样。因为其在大体解剖和器官功能上都与人有很高的相似性，所以常常被作为疾病研究临床模型、再生医学研究的实验动物，是人类异种器官移植的首选器官供体。在利用基因工程技术敲除猪自身逆转录病毒和特异性抗原基因后，异种器官移植技术取得了巨大的进步。其中，猪心瓣膜早已作为原料用于人类心脏瓣膜替换。2022年，美国马里兰大学griffith研究团队报道了全球首例猪心移植手术，患者在术后存活两个月，为异种器官移植带来了曙光。诱导多能性干细胞和扩展多能干细胞系的出现解决了胚胎干细胞在获取和使用上的伦理争论。利用猪多能干细胞构建干细胞向心肌细胞分化体系，有利于实现以猪多能干细胞为原料的心肌细胞生成，推动哺乳动物心肌发育过程研究，可以为人类心肌细胞诱导和移植治疗提供参考。

技术实现思路

1、本发明的目的是建立一种有效的2d诱导培养体系，提供一种将多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供猪的epsc和人h9细胞系等多能性干细胞，所述的干细胞具有向三胚层分化的潜力。

3、本发明第二方面提供一种利用chir99021，xav939，bmp4，activin a等小分子将猪epsc和人esc向中胚层诱导分化的方法。

4、本发明第三方面提供一种利用bfgf ，vegf ，vc ，iwr-1，ra等小分子将中胚层细胞诱导分化为心肌祖细胞的方法。

5、本发明第四方面提供一种利用bfgf，vegf，vc，bmp4，fgf10等小分子将猪心肌祖细胞诱导分化为心肌细胞的方法。

6、在前述方法中，各小分子的最适浓度如下：

7、10 ng/ml bmp4，20 ng/ml activin a，10 ng/ml bfgf，5 ng/ml vegf，5μm iwr-1，650μg/ml vc，1μm ra，5 ng/ml bfgf，5 ng/ml vegf，975μg/ml vc,10 ng/ml bmp4，25ng/ml fgf10。

技术特征：

1.一种化学试剂，其特征在于，该化学试剂按照使用时期分为三个阶段，分别称为ⅰ期培养基，ⅱ期培养基，ⅲ期培养基。。

2.根据权利要求1所述的化学试剂，ⅰ期培养基包括有chir99021，xav939，bmp4，activin a小分子，并且对于猪epsc，最适工作浓度与比例如下：bmp4浓度为10 - 20 ng/ml，activin a浓度为10 - 20 ng/ml。bmp4: activin a比例1:2。

3.根据权利要求1所述的化学试剂，ⅱ期培养基包括有bfgf ，vegf ，vc ，iwr-1，ra小分子，并且对于猪epsc，最适工作浓度与比例如下：10-20 ng/ml bfgf，5 -10ng/ml vegf，1-5μm iwr-1，50-650μg/ml vc，1-10μm ra。

4.根据权利要求1所述的化学试剂，ⅲ期培养基包括有bfgf，vegf，vc，bmp4，fgf10小分子，并且对于猪epsc，最适工作浓度与比例如下：5 ng/ml bfgf，5 ng/ml vegf, 975 μg/mlvc, 10 ng/ml bmp4，25 ng/ml fgf10。

5.根据权利要求2-4所述的化学试剂，对106个猪epsc进行诱导，于37℃恒温培养箱中培养，每24h更换新鲜培养液，保证营养以及小分子的维持。

6.根据权利要求2所述的化学试剂，对106个猪epsc进行中胚层诱导，持续2天。

7.根据权利要求3所述的化学试剂，对权利要求6获得的中胚层细胞进行心肌祖细胞诱导，持续2天。

8.根据权利要求4所述的化学试剂，对权利要求7获得的心肌祖细胞进行心肌细胞诱导与成熟，持续6-14天。

9.权利要求5-8所获得的心肌中胚层细胞系、心肌祖细胞系、心肌细胞系。

10.权利要求9所述细胞系在心脏疾病致病机制研究，异种移植以及药物筛选中的应用。

技术总结
本发明涉及干细胞生物技术领域，公开了一种利用小分子诱导多能性干细胞（PSC）获取心肌细胞的试剂和技术体系。本发明的诱导体系涉及bFGF、RA、XAV939、Activin A、Chir99021、BMP4、FGF 10等小分子以及细胞因子，并以固定比例在不同时期添加，用以诱导扩展多能干细胞（EPSC）和胚胎干细胞（ESC）等向心肌细胞分化。本发明实现多能干细胞向心肌细胞的2D分化，可在20天内获得心肌细胞，为心脏疾病模型构建以及药物筛选提供稳定的研究平台。

技术研发人员：华进联,徐文杰,吴筱洁,史宏昭,陈静,杨昕淳,吴晓龙,李娜
受保护的技术使用者：西安九州医学中心有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5