一种抑制ASGPR-1基因的寡核苷酸或其药学上可接受的盐及应用的制作方法

本发明属于生物医药，尤其涉及一种用于抑制asgpr-1基因表达的寡核苷酸或其药学上可接受的盐及应用。

背景技术：

1、心血管疾病是全球导致死亡的首要原因之一。非高密度脂蛋白(non-hdl)胆固醇和低密度脂蛋白(ldl)胆固醇水平与冠状动脉疾病和心肌梗死的风险之间存在因果关系。非hdl胆固醇已被证明比ldl胆固醇更能预测心血管风险，因为它包含所有含胆固醇的促动脉粥样硬化脂蛋白，包括ldl胆固醇、极低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、脂蛋白(a)和乳糜微粒。目前的降脂药物主要通过三种机制降低血脂水平，他汀类药物主要降低胆固醇的合成和增加低密度脂蛋白(ldl)的重吸收，依折麦布(ezetimibe)抑制肠道对胆固醇吸收，pcsk9抑制剂增加肝脏对ldl的重吸收。目前，尚没有通过靶向胆固醇降解或排泄的降脂药物上市。虽然有多种降脂药物上市，但仍有大部分患者存在复发性心血管疾病的风险，其胆固醇水平控制在目标范围内。因此，新型降胆固醇药物亟待开发。

2、肝去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，asgpr)，在啮齿动物和人类中高度表达和保守，由高度同源的主要(asgpr-1)和次要(asgpr-2)亚基组成。asgpr-1主要表达在肝实质细胞膜上，具有识别和调控细胞的内吞作用、介导多种去唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解，通过介导具有暴露的末端半乳糖或n-乙酰半乳糖胺残基的糖蛋白的内吞作用和溶酶体降解，在血清糖蛋白稳态中起关键作用。

3、2016年人类遗传学研究已经确定，与非携带者相比，去唾液酸糖蛋白受体asgpr-1亚基功能丧失变异等位基因的人类携带者血清中非高密度脂蛋白(hdl)胆固醇水平较低，冠状动脉疾病和心肌梗死的风险较低。因此，靶向asgpr-1功能的疗法代表了一种降低非hdl胆固醇水平和治疗心血管疾病，特别是冠状动脉疾病的新方法。

4、2022年宋保亮研究团队通过敲除细胞中asgpr-1，并进行rna测序、多种动物实验等多方面证实了asgpr-1通过mtor/ampk→brca1/bard1→lxr→abcg5/g8通路调控脂代谢的详细机制。去唾液酸糖蛋白与位于肝细胞膜上的asgpr-1结合，通过网格蛋白介导的内吞作用进入到溶酶体中，在溶酶体酸性条件下被降解成游离氨基酸等营养物质激活溶酶体表面的mtorc1及抑制ampk来调节胆固醇代谢。增加下游泛素连接酶brca1/bard1的蛋白水平，促进lxr蛋白降解。而当asgpr-1缺失或被抑制时，糖蛋白内吞和溶酶体降解减少，溶酶体内的氨基酸水平降低，从而抑制了mtorc1并激活了ampk。一方面，ampk通过降低e3泛素连接酶复合物brca1/bard1来引起lxr增多，使abcg5/g8表达增加，胆固醇外排增多；另一方面ampk抑制胆固醇调节元件结合蛋白(srebp)通路，防止脂肪酸合成增加。总之，靶向asgpr-1上调lxrα、abca1和abcg5/g8，抑制srebp1和脂肪生成，从而促进胆固醇排泄和降低血脂水平。综上所述，asgpr-1缺失会抑制胆固醇生成，是降血脂潜在的治疗靶点。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种用于抑制asgpr-1基因表达的寡核苷酸或其药学上可接受的盐、缀合物、组合物及应用，具体的技术方案如下：

2、本发明第一方面提供一种抑制asgpr-1基因的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，包含正义链和反义链，所述正义链如seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8所示的不超过3个核苷酸差异的核苷酸序列；所述反义链如seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17或seq id no:18所示的不超过3个核苷酸差异的核苷酸序列；所述正义链与所述反义链至少80％互补。

3、进一步地，所述正义链为长度为19-25个核苷酸(碱基)。

4、进一步地，互补的正义链和反义链至少包含1个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立地选自2’-甲基修饰的核苷酸、2’甲氧基修饰的核苷酸、2’-氨基乙基修饰的核苷酸、2’-o-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸、连接于胆固醇基衍生物或月桂酸二癸酰胺基团或vp的末端核苷酸。

5、进一步地，修饰的核苷酸选自2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸(unlocked nucleotide)、构象限制核苷酸、约束乙基核苷酸(constrained ethyl nucleotide)、无碱基核苷酸、2’-氨基-修饰的核苷酸、2’-烷基-修饰的核苷酸、2’-o-烯丙基修饰的核苷酸、2’-c-烯丙基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸等。

6、进一步地，所述正义链与所述反义链包含硫代磷酸酯基修饰和乙烯基磷酸酯基修饰。

7、进一步地，所述硫代磷酸酯基修饰位于正义链末端，包含至少1个，且不超过3个硫代磷酸酯基修饰；所述硫代磷酸酯基修饰位于反义链末端，包含至少1个，且不超过3个硫代磷酸酯基修饰；所述乙烯基磷酸酯基修饰位于反义链第1位。

8、进一步地，所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐的正义链如seq idno:23、seq idno:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq idno:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq idno:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41或seqid no:42所示的不超过3个核苷酸差异的修饰核苷酸序列；其反义链的核苷酸序列如seqid no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50或seq id no:51、seq id no:52、seq id no:53、seq id no:54或seq id no:55、seq id no:56、seq id no:57、seq id no:58、seq id no:59、seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62、seq idno:63或seq id no:64所示的不超过3个核苷酸差异的修饰核苷酸序列。

9、在一个实施方案中，所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐，不包含3’突出端端。另一个实施方案中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。在另一个实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。

10、进一步地，所述寡核苷酸包括sirna、shrna、mirna或aso等。

11、本发明第二方面提供了一种缀合物，包括配体和通过配体缀合的如上所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐，所述配体缀合在正义链3’末端或/和5’末端；更进一步地，所述配体缀合在正义链3’末端。

12、进一步地，所述配体为去唾液酸糖蛋白受体的配体。

13、进一步地，所述配体为半乳糖或n-乙酰半乳糖胺，优选3价或4价态n-乙酰半乳糖胺，更优选4价态n-乙酰半乳糖胺。

14、进一步地，所述缀合物的结构如式(i)下所示：

15、

16、其中，r1结构如式(ⅱ)所示，r2为氧、硫或碳等原子，优选碳原子；q为磷酸酯、碳酸脂或硫酸酯等，优选磷酸酯；n为4-10，优选4；nu为功能性寡核苷酸；

17、

18、其中r3为h离子、乙酰基、苄基或叔丁氧羰基等，优选乙酰基或氢离子；n1为1-6，优选1。

19、进一步地，所述缀合物的结构如式(ⅲ)下所示：

20、

21、即r1结构如式(ⅱ)所示，r2为碳原子；q为磷酸酯；n4；nu为功能性寡核苷酸；r3为乙酰基或氢离子；n1为1。

22、本发明第三方面提供了一种组合物，含有如上所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体；所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体重量比为1：1-500，优选的重量比为1:1-50。

23、其中，所述药学上可接受的载体可以为本领域常规采用的各种载体，包括但不限于脂质体、聚合物、多肽、蛋白、单抗、外泌体、纳米材料等。所述脂质体为可离子化脂质，优选阳离子脂质体。

24、进一步地，所述药学上可接受的载体还含有辅助脂质和聚乙二醇化脂质。所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。

25、进一步地，所述药学上可接受的载体含有有机胺。

26、进一步地，所述药学上可接受的载体含有去唾液酸糖蛋白受体的配体，优先半乳糖或n-乙酰半乳糖胺，优选3价或4价态n-乙酰半乳糖胺，更优选4价态n-乙酰半乳糖胺。

27、进一步地，所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐、缀合物或组合物，包括但不限于药学上可接受的赋形剂、稀释剂、缓冲剂或稳定剂等。

28、本发明第四方面提供一种如上所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐、缀合物或组合物在制备用于预防、治疗或缓解asgpr-1相关疾病和症状的药物中的用途。

29、本发明第五方面提供了一种用于预防、治疗或缓解asgpr-1相关疾病和症状的方法，该方法包括将如第一方面所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐和/或如第二方面所述缀合物和/或如第三方面所述组合物给予有需要的患者。

30、本发明第六方面提供一种用于抑制肝细胞中asgpr-1基因表达的方法，该方法包括将如第一方面所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐和/或如第二方面所述缀合物和/或如第三方面所述组合物导入所述肝细胞。

31、本发明第一方面所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐和/或如第二方面所述缀合物和/或如第三方面所述组合物可有效的预防、治疗或缓解asgpr-1相关疾病和症状。具体表现为，在细胞水平上，所述寡核苷酸或其药学上可接受的盐对asgpr-1基因的抑制效果可达到80％以上；当皮下给药时，缀合物的配体可以有效的将rnai递送到肝脏，血浆中asgpr-1含量明显下降。

32、通过上述技术方案，本发明提供的寡核苷酸或其药学上可接受的盐、缀合物和组合物，能够显著抑制asgpr-1基因的表达水平，可有效的预防、治疗或缓解asgpr-1相关疾病和症状，疗效确切、副作用小、依从性高，实现对患者血压的有效、长期控制。sirna在hep 3b细胞的asgpr-1基因表达的抑制有显著效果，抑制效果能达到85％；修饰后sirna在hep 3b细胞的asgpr-1基因表达的抑制效果能达到85％；sirna缀合物采用皮下给药后，可以显著降低小鼠血液中asgpr-1蛋白水平。