利用壳聚糖磁性材料对肝素酶II的固定化方法与流程

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法。

背景技术：

1、肝素酶是多糖裂解酶（ec 4.2.2）中的一员，目前大多数研究集中在微生物来源的肝素酶上，最初肝素酶是从肝素黄杆菌（flavobacteriumheparinum）中分离出来，在其他微生物来源中也有发现，如：拟杆菌（bacteroidesthetaiotaomicron）、粪便拟杆菌（bacteroidesstercoris）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）以及棒杆菌（corynebacterium sp.）等，但至今肝素黄杆菌仍然是商品肝素酶的唯一来源。

2、肝素的酶解可由三类具有不同特异性的酶催化，即肝素酶i、ii 和iii。三种肝素酶均是通过β-消除机制作用于glcn和 hexa之间 的1→4糖苷键内聚解聚肝素，从而在非还原性末端形成含有c=c不饱和键的不饱和糖醛酸（δua）。肝素酶ii属于pl21家族（ec4.2.2-）, 和肝素酶ｉ一样是 一类内切型hp/hs裂解酶。肝素酶ii催化连接到idoa/glca和idoa2s/glca2s的a-1，4糖苷键的断裂，因此肝素酶ii对hp和hs没有选择性。现阶段使用最广，已投入商品化使用的肝素酶ii来自于肝素黄杆菌。其是一种可以以肝素和硫酸乙酰肝素为底物的酶，具有清除血液中残存肝素、防止凝血的功能；同时对低分子量肝素的制备、肝素降解产物的结构研究等领域具备十分重要的作用。然而肝素黄杆菌发酵所得的游离酶在上述实际应用中存在不足，如游离酶与底物和产物的分离纯化难度高，热稳定性低、酶易失活、无法重复利用和成本高等，为产业化开发应用带来严重阻碍，因此，亟需开发一种可提高肝素酶热稳定性、易回收和高效催化的方法。

3、酶的固定化是指利用物理吸附或化学结合法将游离酶固定在载体上或束缚在一定的空间内，通过连续使用或反复使用来提高酶的利用率的一种技术。常用的固定化方法有包埋法、吸附法、共价结合法和交联法。固定化酶和游离酶相比，具有热稳定性高、成本低、易控制、对变性剂耐受性强等优点，可重复或连续使用，且易于与产品分离，是生物医药领域尤其在肝素多糖领域研究较少，公布的专利cn102888391 a开展了壳聚糖固定化肝素酶ii的研究成果，但在产业化应用中发现该固定化酶的耐高温存在不足。

4、壳聚糖链上存在较活泼的一级胺基和羟基，能和多种基团反应制备得到各样衍生物，大大提高了它的使用范围和应用价值，是一种资源量丰富、性质独特、多功能的天然高分子生物材料。本发明人一方面通过冻融的方法得到壳聚糖水凝胶，改变了以往通过酸溶而导致机械强度低、不耐高温等缺点。另一方面利用壳聚糖对重金属离子具有良好的吸附性能，利用壳聚糖基质中存在的氨基，这些氨基通过离子交换和络合反应与溶液中的金属离子相互作用，进一步提高壳聚糖水凝胶的机械强度和热稳定性，进而将其应用到肝素酶ii的耐高温酶产业化应用中，实现提升生产效率和节约生产成本的绿色生物制造领域。

技术实现思路

1、针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供开发出一种高效、耐温性、低成本和可多次重复使用的磁性复合材料微球固定化肝素酶ii的方法，成功实现肝素酶ii热稳定性显著提升，为其产业化应用提供有力的技术保障。

2、为实现上述目的，本发明提供一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

3、s1:将磁性壳聚糖-海藻酸钠微球加入0.8%的乙二醇二缩水甘油醚溶液，放入摇床在条件25℃ 、250rpm中 1小时后取出，得到处理后的磁性壳聚糖-海藻酸钠微球；

4、s2：将制备好的肝素酶ii溶液利用注射器匀速加入处理后的磁性壳聚糖-海藻酸钠微球中进行交联固定，然后置于25℃ 250rpm的摇床中继续摇晃10小时以上，然后用pbs缓冲液洗涤3次至无肝素酶蛋白被洗出，得到微球制品，在4℃保存备用；

5、s3: 用乙酸-乙酸钠和pbs两种缓冲液分别洗涤所得的微球制品，直至洗脱液中无法检测到肝素酶ii，然后利用清除溶剂进行再次清洗，即得到固定在磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球材料的肝素酶ii。

6、作为优选，在步骤s1前，还包括肝素酶ii溶液的制备，具体步骤为：选择pbs缓冲液作为肝素酶ii溶剂，将肝素酶ii冷冻浓缩后溶解到pbs缓冲液中，搅拌均匀后得到一定浓度的酶溶液；其中pbs缓冲液含有zncl2或cacl2，ph值为6.5，pbs的浓度为20-80mm，zncl2/cacl2浓度为5-40mm。

7、作为优选，在步骤s2中，磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球与肝素酶ii溶液的摩尔比为1：（10-40）。

8、作为优选，在步骤s1中，乙二醇二缩水甘油醚溶液浓度为0.5-2.0%；且从摇床中取出后采用去离子水进行清洗，除去残留的乙二醇二缩水甘油醚溶液。

9、作为优选，在步骤s3中，乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为20-200mm乙酸-乙酸钠缓冲液，其中ph为6.0-8.0，含有20-100mm zncl2 或20-200mm cacl2。

10、作为优选，在步骤s3中，清除溶剂为碱金属硼氢化物、戊二醛、蹂酸和亚硫酸钠中的一种。

11、本发明的有益效果是：本发明实现了肝素酶ii的磁性化固定，提高了酶的热稳定性、可重复利用和易分离纯化。该方法可显著提高肝素酶的热稳定性和固定化催化活力，每毫升的壳聚糖-海藻酸钠磁性微球可固定化2-5iu的肝素酶ii，热稳定性相对游离酶提高100-350%，固定化的肝素酶ii重复使用3次后仍保留58.6%的活性。

技术特征：

1.一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤s1前，还包括肝素酶ii溶液的制备，具体步骤为：选择pbs缓冲液作为肝素酶ii溶剂，将肝素酶ii冷冻浓缩后溶解到pbs缓冲液中，搅拌均匀后得到一定浓度的酶溶液；其中pbs缓冲液含有zncl2或cacl2，ph值为6.5，pbs的浓度为20-80mm，zncl2/cacl2浓度为5-40mm。

3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤s1中，磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球与肝素酶ii溶液的摩尔比为1：（10-40）。

4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤s1中，乙二醇二缩水甘油醚溶液浓度为0.5-2.0%；且从摇床中取出后采用去离子水进行清洗，除去残留的乙二醇二缩水甘油醚溶液。

5.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤s3中，乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为20-200mm乙酸-乙酸钠缓冲液，其中ph为6.0-8.0，含有20-100mm zncl2 或20-200mmcacl2。

6.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤s3中，清除溶剂为碱金属硼氢化物、戊二醛、蹂酸和亚硫酸钠中的一种。

技术总结
本发明涉及一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶II的固定化方法，尤其涉及以壳聚糖和海藻酸钠为固定化原料，制备出力学性质优良且耐高温的壳聚糖－海藻酸钠复合水凝胶，对具备耐高温特性的肝素酶II进行固定化的方法。肝素酶II固定化后具备热稳定性、可回收、可重复多次利用、产物分离与回收效率高等优势，极大提升了系列肝素酶在超低分子量肝素制备领域的产业化应用价值。

技术研发人员：苏国栋,孙健,胡坤,谢贵兵,魏才学,张平,李锂
受保护的技术使用者：深圳市天道医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15