一种抗人B7-H4IgY抗体的制备方法及其应用与流程

本发明涉及免疫应用的，具体涉及一种抗人b7-h4 igy抗体的制备方法及其应用。

背景技术：

1、在肿瘤免疫中，t细胞介导的免疫应答反应起重要作用。目前认为，激活t细胞需2条各自独立的信号通路。主要组织相容性复合物(mhc)与t细胞抗原受体(tcr)结合，提供t细胞活化的第1条信号通路；共刺激因子与t细胞表面受体结合，提供t细胞活化的第2条信号通路。肿瘤细胞表面可表达mhcⅰ类抗原因子，同时可异常表达共刺激因子，从而根据共刺激因子的正性或负性刺激作用形成对免疫反应的正负调节作用。已明确的共刺激因子包括b7/cd28超家族、cd2超家族、肿瘤坏死因子(tnf)/tnf受体(tnfr)超家族以及部分整合素家族。在复杂的免疫应答过程中，共刺激因子呈调节性表达，各家族的作用各不相同或略有重叠。

2、b7家族对t细胞免疫应答起正性和(或)负性调节作用，b7家族的免疫调节蛋白由多个成员组成，主要有b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1(b7-h1，cd279)、pd-l2(b7-dc，cd273)、b7-h2(icosl，cd275)、b7-h3(cd276)、b7-h4、b7-h5(vista)、b7-h6和b7-h7(hhla2)，所有这些都是膜锚定蛋白，都具有细胞外免疫球蛋白样结构域，对其配体的结合很重要。b7-h4是在2003年由3个不同实验室同时发现，并分别命名为b7-h4、b7s1和b7x。b7-h4属于常见的负性共刺激因子，主要表现为抑制t细胞的增殖、g0/g1期的细胞周期进程和il-2的产生。b7-h4基因在人体组织广泛表达，但在正常人类组织不表达或极低表达，而在多种肿瘤组织中发现b7-h4高表达。目前，在许多不同类型的人类恶性肿瘤组织中均已检测到b7-h4蛋白的高表达。有研究表明，在82.76％的卵巢恶性肿瘤组织、75％的乳腺癌组织，以及90.6％结直肠癌组织中均检测到b7-h4蛋白的表达，宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、自身免疫性疾病等也都有b7-h4蛋白的表达。研究表明，b7-h4蛋白也以可溶性形式(sb7-h4)存在于肿瘤患者的血清中，2006年首次报道了卵巢癌患者不仅在细胞膜上有b7-h4蛋白的表达，在患者血清中也检测到高水平b7-h4蛋白。此外，sb7-h4在非小细胞肺癌、肾癌、肝癌、类风湿性关节炎等疾病血清中均有高表达。相关统计学分析表明，b7-h4蛋白在肿瘤中的表达水平往往与肿瘤的发生发展、患者的预后等密切相关。因此，b7-h4被认为是一种新型广谱肿瘤标志物。

3、大量研究报道，b7-h4在各种肿瘤中成基础性表达，可作为诊断肿瘤的生物标志物，这与肿瘤的不良预后和高复发率密切相关。在几乎所有的浸润性导管和小叶乳腺癌中，b7-h4弥漫地存在于整个细胞质中。已经观察到b7-h4阳性细胞的比例与pr阴性状态、her-2/neu阴性状态和新辅助化疗史之间存在明显的相关性。b7-h4蛋白高表达的乳腺癌患者的复发时间更长。b7-h4蛋白在原发性和转移性浆液性、子宫内膜性、透明细胞和上皮性卵巢癌中也有高表达，但在粘液性和非上皮性卵巢癌中表达较低。此外，b7-h4蛋白在恶性肿瘤中的水平与癌前病变和良性卵巢肿瘤中的水平截然不同。研究发现，b7h4-pdl1分类法可识别宫颈癌的免疫原性，预测增殖亚型和有限的治疗选择，可能是一种方便可行的临床标志物。在非小细胞肺癌(nsclc)中，b7-h4的高表达与淋巴结转移和肿瘤浸润淋巴细胞(tils)明显相关。在肾细胞癌(rcc)中，b7-h4的表达与临床病理特征有关，包括全身症状、肿瘤体积大、肿瘤分期和分级高、肿瘤凝固性坏死、淋巴细胞浸润和肿瘤侵袭。

4、研究表明，在有炎症、自身免疫性疾病、病毒感染或怀孕的个体中检测到b7-h4的异常表达。在类风湿滑膜中，chen等检测到b7-h4在cd31+内皮细胞、cd34+新血管内皮细胞、cd68+巨噬细胞、滑膜细胞、cd19+b细胞和cd14+单核细胞的膜和胞质上的表达。此外，b7-h4被发现参与了ra进展过程中滑膜的病理变化。b7-h4在系统性红斑狼疮中过度表达，与疾病的发展有关。

5、研究表明，b7-h4以血清可溶性形式存在(sb7-h4)，在肿瘤、炎症、自身免疫性疾病和妊娠中高度表达。sb7-h4在肿瘤患者中高度表达，包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等，是预测癌症患者进展和预后的潜在标志物。sb7-h4和癌胚抗原对良性和恶性胸腔积液有诊断价值。恶性胸腔积液中的sb7-h4水平高于非恶性胸腔积液。此外，sb7-h4的水平与生存率呈负相关。在结直肠癌和恶性胸腔积液中，sb7-h4加cea可显著提高诊断的敏感性和特异性。在经历自然分娩的妇女中，没有观察到分娩前后的差异。自发分娩的妇女在分娩前的血清sb7-h4水平高于接受选择性剖腹产的妇女。血清中sb7-h4水平的变化表明，该蛋白参与了自发分娩和分娩后与平衡有关的免疫学变化。早产破裂的胎儿血清sb7-h4水平增加，表明在胎儿和母体界面有动态免疫反应。因此，sb7-h4也可作为妊娠并发症的预测指标。在怀孕的前三个月，sb7-h4可能是妇女高危妊娠毒血症的预测指标。

6、卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin yolk，简称igy)也叫卵黄抗体，是一种普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类的一种抗体，在功能上等价于哺乳动物igg。近年来许多研究者分析了igy的基因组成和生物学功能，而且证实其为哺乳动物igg和ige的直接起源。蛋鸡经外来抗原刺激后产生免疫应答生成相应抗体，该抗体经血液后能够选择性的贮存在卵黄中，蛋黄中的这种抗体被称为鸡卵黄抗体。与产生于哺乳动物的igg相比，igy具有许多独特的优点，如成本低、产量高、耐酸、耐碱、耐高温，性能稳定，便于保存和运输；选用的生产主体为禽类，不需要采集血液，符合考虑动物福利的总趋势；具有高效性，使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性igy；由于结构差异和系统发育距离，igy比哺乳动物抗体更适合用于诊断，因为它不与人类免疫系统的某些成分发生反应，对哺乳动物保守蛋白表现出更大的亲和力，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果；由于种系发生距离相差很大，禽类igy与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应等等。

7、“igy技术”的起源可以追溯到1893年，当时klemperer等人进行了一项实验，证明从蛋黄中提取的免疫球蛋白能够对细菌毒素提供保护。在将近100年的时间里，这一领域没有取得重大进展。然而，自20世纪80年代以来，由于基于这些特异性抗体的治疗和诊断测试的发展，igy技术的使用有所增加，这些抗体与经典标记物(如荧光素、碱性磷酸酶和过氧化物酶结合。目前，可以找到一千多篇与igy技术相关的科学文章，且自2008年以来呈指数增长。

8、近年来，由于igy比哺乳动物的igg更有优势，因此吸引了大量的关注。目前，从家禽中获得并从蛋黄中纯化的igy抗体已经被测试为诊断和治疗癌症以及感染性、自身免疫性和过敏性疾病的工具。特别是，它们被用来对付导致人类和动物呼吸系统疾病的病毒和细菌。因此，在最近由sars-cov-2病毒引起的大流行期间，据报道世界各地都在努力实施特异性的单克隆和多克隆igy抗体，用于诊断和转移被动免疫，以快速和安全的方式治疗和预防感染。使用igy抗病毒的其他例子包括中东呼吸综合征(mers)、轮状病毒、流感、寨卡病毒、登革热和埃博拉的管理等。在轮状病毒的情况下，已经有了更多的进展，因为特定的igy已经在动物和人类中进行了测试，并已被证明可以减少由该病毒甚至由混合感染新生儿的细菌病原体引起的腹泻。就流感病毒而言，针对禽流感h5n1和h9n2病毒的igy抗体可有效中和。因此，被建议用于治疗鸟类和人类。igy中缺乏哺乳动物fc受体结合区域已被证明是抗体依赖性增强(ade)免疫现象的治疗替代方案。此外，由于igy耐酸、耐碱、耐高温，性能稳定等优点，被研究用于肠道疾病的治疗，例如，针对大肠杆菌肠毒素的特异性igy被提议作为食品强化元素，因为它可以在65℃的高温巴氏灭菌15分钟，而不影响其中和活性，保持体外抑制大肠杆菌生长的能力。研究发现，igy被认为可以对抗与外科医院感染相关的细菌，如表皮葡萄球菌，甚至可以对抗结核病，能够对抗呼吸道和肺部的细菌负荷。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种抗人b7-h4 igy抗体的制备方法，该制备方法制得的抗人b7-h4 igy抗体特异性高、亲和力高，可以结合重组表达人b7-h4蛋白。

2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

3、一种抗人b7-h4 igy抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

4、(1)b7-h4蛋白igy免疫原的设计与合成：

5、根据b7-h4蛋白的氨基酸序列，筛选出免疫原性较强的分属两个结构域多肽，分别制备出与klh载体偶联的多肽和与bsa载体偶联的多肽，得到多肽-klh、多肽-bsa和未偶联载体的纯肽；

6、(2)母鸡的免疫：

7、准备20只20-25周龄的母鸡，用1条多肽-klh免疫10只母鸡，用0.5ml的pbs溶解1mg的多肽-klh，再用0.5ml的弗氏完全佐剂乳化，对母鸡进行首次免疫，用0.25ml的pbs溶解0.5mg的多肽-klh，再用0.25ml的弗氏不完全佐剂乳化，对母鸡进行加强免疫；

8、(3)抗体的粗纯化：

9、收集每只母鸡生产的鸡蛋，只保留蛋黄，搅破蛋黄，滤掉蛋黄膜，将蛋黄放入容器中，按照蛋黄:水以1:9的体积比加入纯水，将蛋黄溶液搅拌均匀，随后缓慢加入盐酸，调节蛋黄溶液的ph值，待ph值稳定后将蛋黄溶液放在2-8℃的冰箱中，静置过夜，采用硫酸铵沉淀法进行抗体粗提纯，次日低温离心，取沉淀，得到粗提抗体，将粗提抗体直接保存或加水溶解；

10、(4)抗体的除盐：

11、用高速离心机对粗提抗体离心，离心后将上清液吸出，再用滤膜过滤上清液备用，用5倍g25凝胶柱体积的纯水冲洗g25凝胶柱，再用5倍g25凝胶柱体积的pbs平衡g25凝胶柱，将核酸蛋白检测仪设置为0，再用小于g25凝胶柱1/4体积的上清液过g25凝胶柱进行抗体除盐，待核酸蛋白检测仪上的数值升高后，开始收集样本，待核酸蛋白检测仪上的数值下降至5-10后，停止收集样本，得到抗体粗品；

12、(5)抗体的纯化与透析：

13、先将两种b7-h4纯肽偶联在亲和凝胶上，再将亲和柱与蠕动泵连接在一起，用pbs清洗亲和柱0.5h，再用蠕动泵将抗体粗品泵入亲和柱中，泵入后再继续循环过夜，次日用pbs冲洗亲和柱30min，洗脱亲和柱内的杂蛋白，洗脱完全后，再用ph为3.0的甘氨酸洗脱液洗脱亲和柱内的结合蛋白，用tris9.0调节结合蛋白的ph值，计算结合蛋白的质量和浓度，将洗脱下来的结合蛋白在4℃下离心，弃去壁上沉淀，将上清液放入透析袋中，用pbs8.0在4℃下过夜透析，次日收集结合蛋白，用bca法测结合蛋白的浓度，可用50kd的超滤管对蛋白进行浓缩。

14、优选地，步骤(1)中，分属两个结构域多肽的序列分别为多肽1：fkegkdelseqdemf和多肽2：endiakatgdikvteseikr。

15、优选地，步骤(2)中，首次免疫时和加强免疫时，用75％的酒精喷洒擦拭母鸡胸背部羽毛，在母鸡两侧的胸背部进行乳化剂多点皮下注射，首次免疫后，每隔14天进行加强免疫，首次免疫前和每次加强免疫前，进行抽血分离血清监测抗体效价，待血清抗体效价平稳后，每隔一个月进行维持免疫。

16、优选地，监测抗体效价采用间接elisa法，首次免疫前和每次加强免疫前，每条肽段任意抽选2只母鸡，在抽选的母鸡翅下进行静脉抽血，肽1选取1115号和1116号母鸡抽血，肽2选取1125号和1126号母鸡抽血，用0.5μg/ml的多肽-bsa包被板条，在4℃下过夜包被，次日弃去包被液，用pbst清洗1-3次，加入200μl的封闭液，在37℃下孵育1h，弃去封闭液，用pbst清洗3次，将每次免疫前收集的血清从1:500开始稀释，进行2倍梯度稀释，在37℃下孵育1h，弃去样本，用pbst清洗3次，加入100μl的1:250稀释的生物素化驴抗鸡抗体，在37℃下孵育1h，弃去抗体，用pbst清洗3次，加入100μl的1:1000稀释的sa-hrp，在37℃下孵育1h，弃去孔内液体，用pbst清洗3次，用tmb温箱37℃显色15min，加终止液终止，上机检测od值。

17、优选地，步骤(3)中，蛋黄溶液的ph值为5.0。

18、优选地，步骤(3)中，当蛋黄溶液量小于1l时，采用一步硫酸铵沉淀法，次日取出蛋黄溶液低温离心，以6200rpm速率离心处理25min，取上清液，将上清液的ph值调至5.5，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至饱和度为40％，在2-8℃下冷藏过夜，次日低温离心，取沉淀，得到粗提抗体，将粗提抗体直接保存或加水溶解。

19、优选地，步骤(3)中，当蛋黄溶液量大于1l时，采用两步硫酸铵沉淀法，次日取出蛋黄溶液低温离心，以6200rpm速率离心处理25min，取上清液，将上清液的ph值调至5.5，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至饱和度为55％，在2-8℃下冷藏过夜，次日低温离心，取沉淀，加入上清液体积1/2的纯水溶解，将溶液的ph值调至5.5，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至饱和度为33％，在2-8℃下冷藏过夜，次日低温离心，取沉淀，得到粗提抗体，将粗提抗体直接保存或加水溶解。

20、优选地，步骤(4)中，粗提抗体的离心转速为12000rpm，粗提抗体的离心时间为10min，过滤的滤膜为0.45μm。

21、优选地，步骤(5)中，用蠕动泵将抗体粗品泵入亲和柱为在2-8℃下泵入6-8h，结合蛋白的ph值为7.4-8.0，结合蛋白的离心转速为12000rpm，结合蛋白的离心时间为10min。

22、本发明还提供了抗人b7-h4 igy抗体的应用，抗人b7-h4 igy抗体通过免疫学方法用于检测人b7-h4蛋白的表达水平，通过双抗体夹心elisa方法用于检测人外周血清中可溶性b7-h4，通过fcm方法用于检测跨膜表达的b7-h4蛋白，通过wb方法用于免疫学基础研究。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

24、本发明制备了一种特异性高、亲和力高的抗人b7-h4 igy抗体，该抗人b7-h4 igy抗体可以结合重组表达人b7-h4蛋白，通过elisa、wb、fcm等免疫学方法能够更灵敏地检测出人外周血中b7-h4蛋白的表达水平；与常规的igg抗体相比，igy抗体具有高效性、高灵敏性和特异性、成本低、产量高、耐酸、耐碱、耐高温，便于保存和运输、制备周期短、符合动物福利的优点。