一种用于miRNA检测的探针及其检测方法和应用

本发明涉及检测，具体涉及一种用于mirna检测的探针及其检测方法和应用，尤其涉及一种基于表面增强拉曼散射的等温扩增技术用于mirna检测的探针及其检测方法和应用。

背景技术：

1、mirna(microrna)是一类非编码rna，长度约为22个核苷酸，广泛存在于真核生物中。mirna在基因表达调控中发挥重要作用，与许多生物过程及疾病发展密切相关。因此，准确、高灵敏度和特异性地检测mirna对于研究基因表达调控、疾病诊断和治疗具有重要意义。现有的mirna检测方法主要包括基于逆转录聚合酶链反应(pcr)的技术、northern印迹分析以及基于核酸杂交的方法。然而，这些方法存在灵敏度不足、特异性较低、操作复杂等问题。

2、近年来，基于表面增强拉曼散射(sers)的测定法由于具有快速灵敏的分析能力，已成为免疫测定法的颇具潜力的替代方法。sers具有优于荧光的内在优势，包括最小的光致漂白效应，宽的激发波长范围和多重检测的能力。通过基于sers的免疫测定技术研究多种不同类型的生物标记物，包括蛋白质，核酸，小分子等，已经广泛应用于疾病诊断、生物标记和环境监测等领域。在基于sers的免疫测定中，通过电磁和化学显著增强报告分子在sers活性位点(称为“热点”)的拉曼散射信号，可以用来克服传统拉曼光谱法固有的低灵敏度的问题。迄今为止，已发展了多种基于不同金属纳米结构的不同类型的sers探针，包括纳米球，核壳，中空和纳米团簇。这些探针与sers活性基底的相互作用在检测中起着至关重要的作用，当将探针与sers活性基底以三明治形式放置时，会在探针和基底之间的接合处出现“热点”。这一发现为将sers活性基底与sers纳米探针结合用于超灵敏检测提供了可能。

3、此外，mirna是极短的序列，表现出高度的同源性，并且浓度明显较低，在血浆中只有0.01％的总rna质量在pm范围内。这就要求检测方法有足够的灵敏度。滚环扩增(rca)是一种基于级联dna反应的等温扩增技术，该技术是模拟了自然界中环状dna的滚环复制过程，可以在恒温溶液中、固体载体上或复杂的生物环境中进行，以实现模板的指数扩增，与聚合酶链式反应pcr相比，滚环扩增(rca)在室温就可以进行反应，并且操作简单，低成本且速度更快，检测灵敏度高。

4、因此，通过利用滚环扩增(rca)的特点，设计一种特殊的sers探针并实现信号的放大，从而提高mirna检测的灵敏度，是本发明亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的缺点，本发明旨在提供一种快速、准确、侵入性小的mirna检测方法。本发明基于表面增强拉曼散射(sers)和滚环扩增(rca)技术，结合了等温扩增技术和拉曼散射技术，通过设计特殊sers探针并实现信号的放大，从而能够提高mirna检测的灵敏度，通过提供一种新的mirna检测方法，可以克服现有技术中存在的缺点，提高检测的灵敏度和特异性，同时减少对患者的损伤和并发症产生的几率。

2、为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种用于mirna检测的探针，包括挂锁探针、sers探针和含有dna的磁球@zip链，所述挂锁探针能特异性结合mirna、sers探针和磁球@zip链，挂锁探针具有d1-p-zip-p-d2模式结构，包括：

4、目标识别位点：所述目标识别位点包括位于挂锁探针长链两端的核苷酸序列d1和核苷酸序列d2，所述d1和d2能与待检测的mirna完全互补地结合，且在t4 dna连接酶的作用下形成一个圆形结构；

5、sers探针连接子：所述sers探针连接子为与序列d1和d2相连的p区域，所述sers探针连接子用于sers探针的识别和富集；

6、磁珠连接子：所述磁珠连接子zip两端分别与两端的sers探针连接子p连接，所述磁珠连接子zip的核苷酸序列与磁球@zip链上的dna序列互补，使其能够被磁珠识别连接。

7、在本发明的较佳实施方式中，所述sers探针的制备方法包括如下步骤：

8、采用“金种子生成法”制备金纳米颗粒aunps溶液，

9、用拉曼报告分子孔雀石绿异硫氰酸酯mgitc修饰金纳米颗粒aunps，得到sers探针aunp@mgitc。

10、在本发明的另一较佳实施方式中，所述含有dna的磁球@zip链制备方法包括如下步骤：

11、重悬链霉亲和素磁珠，分离去除上清，洗涤，用binding&washing buffer i重悬磁珠，加入生物素标记核酸样品，充分振荡混悬，室温孵育，然后分离去除上清，继续用binding&washing buffer i重悬磁珠，得到含有dna的磁球@zip链。

12、进一步的，所述重悬链霉亲和素磁珠，分离去除上清，洗涤，具体采用如下方法：用移液器轻轻吹打以充分重悬链霉亲和素磁珠，取20μl置于1.5ml离心管中待用，放置于磁力架上分离1min，去除上清，然后加入1x tbs至最终体积为0.5ml，用移液器轻轻吹打重悬链霉亲和素磁珠，置于磁力架上分离10s，去除上清，完成一次洗涤步骤，重复该洗涤步骤2次，最终去除上清，得到洗涤后的链霉亲和素磁珠。

13、更进一步的，所述binding&washing buffer i含有ph 7.5且浓度为10mm tris-hcl,1mm edta,2m nacl,体积分数为0.01％的tween-20。

14、第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的探针在检测mirna中的应用，优选的，mirna为肺纤维化mirna。

15、第三方面，本发明还提供了一种利用如第一方面所述的探针检测mirna的方法，包括如下步骤：

16、进行滚环扩增反应，向反应管中加入待检测的mirna、挂锁探针长链、dna连接酶和反应缓冲液，以mirna作为引物，与挂锁探针长链相互作用成环，然后将成环产物作为模板，加入磁球@zip链作为引物，加入dntp、phi29 dna聚合酶、dtt和反应缓冲液，混合均匀，产生含有待检测的mirna片段的长链产物磁球@rca；

17、向磁球@rca中加入dna-aunp结合物，混合反应，得到磁球@rca@aunp复合物；

18、通过磁球@rca@aunp复合物对sers探针进行识别和富集，检测上清液中sers的信号强度。

19、在本发明的较佳实施方式中，滚环扩增制备成环产物时，将反应管置于室温下进行反应，使padlock链与mirna引物互补并连接成环，待成环产物制备结束后，将反应管加热至65℃，使dna连接酶失活，终止成环反应；滚环扩增制备磁球@rca时，将反应管加热至45℃，使phi29 dna聚合酶在磁球@zip链引物的作用下，沿着成环模板进行连续滚环扩增，待磁球@rca制备结束后，将反应管加热至65℃，使phi29 dna聚合酶失活，终止滚环扩增反应。

20、在本发明的较佳实施方式中，所述反应缓冲液为5x dna ligase reactionbuffer，包括ph 7.6且浓度为250mm tris-hcl,50mm mgcl2,5mmatp,5mmdtt,25％(w/v)polyethylene glycol-8000。

21、在本发明的另一较佳实施方式中，dna-aunp结合物采用如下方法制备：将金纳米颗粒aunps溶液与巯基修饰的dna或dna混合，微波加热反应，用pbs磷酸盐重悬缓冲液，然后用磷酸盐缓冲液洗涤颗粒，离心得到沉淀，将所述沉淀重悬于pbs缓冲液中，得到dna-aunp结合物，所述巯基修饰的dna或dna与所述挂锁探针的sers探针连接子p区域的核苷酸序列相同。

22、与现有技术相比本专利技术具有以下优点：

23、本发明具有以下几个优点：

24、特殊设计的挂锁探针：本发明采用了特殊设计的挂锁探针，该探针无二级结构，能够高效地与目标mirna序列结合。这种结构使得探针更容易与目标序列特异性地结合，提高了检测的准确性。

25、高灵敏度和高特异性：通过结合sers技术和rca技术，本发明能够实现对mirna的高灵敏度和高特异性检测，从而提高检测的准确性和可靠性。

26、操作简便：本发明采用恒温扩增技术，无需复杂的温度控制和周期性升降温操作，大大简化了实验过程和操作难度。

27、成本效益：相较于现有的pcr技术，本发明采用的恒温扩增技术降低了仪器和试剂的成本，使得本技术更具成本效益。

28、广泛应用前景：本发明技术可广泛应用于生物医学研究、疾病诊断和治疗等领域，具有重要的实际意义和应用价值。