一种无动物源补充剂、培养基及其在诱导分化定向内胚层细胞中的应用的制作方法

本发明涉及一种无动物源补充剂、培养基及其在诱导分化定向内胚层细胞中的应用。

背景技术：

1、人胚胎发育过程中，定向内胚层(definitive endoderm，de)的形成是胚胎发育中的关键阶段，它是形成肝脏、肺部、胰腺等内脏器官的前体。

2、多能干细胞hipsc不仅具有无限增值潜能，而且无相关的伦理和道德问题争议，这使得hipsc成为研究和治疗许多疾病的理想选择。研究人员一直在努力开发高效可靠分化方案，诱导多能干细胞hipsc向定向内胚层命运分化。

3、通过技术手段诱导的定向内胚层细胞可以进一步引导它们沿着特定途径分化，获得各种内胚层衍生的功能性细胞如肝细胞、胰岛细胞和肺泡细胞等等。高效诱导定向内胚层分化有潜力革命性地改变再生医学，并为器官衰竭、遗传疾病和其他令人困扰的疾病患者带来新的治疗可能性。

4、现有技术中，诱导定向内胚层细胞的培养基一般是以基础培养基加入各种补充剂配制得到，补充剂一般包括各类活性小分子如生长因子等，但补充剂大多数都含有血清和动物源成分。而临床产品要求细胞制剂不能含有动物源成分，因为动物源成分中可能残留了动物核酸、或感染过的细菌和病毒核酸等，以及可能对受体引起免疫作用的蛋白。虽然可以在后续质量检测时，检测动物源成分，但是药物审批时为了安全性，仍旧不允许使用含有动物源成分的物料，即便只是作为辅助支撑性质的物料。因此，有必要开发无动物源的诱导定向内胚层细胞的补充剂以及培养基。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种用于诱导分化定向内胚层细胞的无动物源补充剂和培养基，成分简单，不含血清等动物源成分，可避免临床应用前动物源成分的检测，更适合临床应用。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一种无动物源补充剂，所述补充剂包括以下组分：

4、生物素、dlα-生育酚醋酸酯、人重组胰岛素、人转铁蛋白、皮质酮、d-半乳糖、盐酸乙醇胺、还原型谷胱甘肽、左旋肉碱盐酸盐、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、亚硒酸钠和三碘甲状腺氨酸。

5、进一步，本发明还提供一种无动物源浓缩补充剂，由上述无动物源补充剂制得，所述无动物源浓缩补充剂为100×浓缩液，以mcdb131培养基为溶剂，包括以下浓度的组分：

6、200～350μg/ml生物素、80～150μg/ml的dlα-生育酚醋酸酯、350～500μg/ml人重组胰岛素、400～600μg/ml人转铁蛋白、1～5μg/ml皮质酮、1000～2000μg/mld-半乳糖、80～150μg/ml盐酸乙醇胺、80～150μg/ml还原型谷胱甘肽、150～300μg/ml左旋肉碱盐酸盐、80～150μg/ml亚油酸、80～150μg/ml亚麻酸、0.5～0.8μg/ml黄体酮、1500～2000μg/ml腐胺、1～2μg/ml亚硒酸钠和0.1～0.5μg/ml三碘甲状腺氨酸。

7、优选所述无动物源浓缩补充剂，以mcdb131培养基为溶剂，包括以下浓度的组分：

8、250μg/ml生物素、100μg/ml的dlα-生育酚醋酸酯、400μg/ml人重组胰岛素、500μg/ml人转铁蛋白、2μg/ml皮质酮、1500μg/mld-半乳糖、100μg/ml盐酸乙醇胺、100μg/ml还原型谷胱甘肽、200μg/ml左旋肉碱盐酸盐、100μg/ml亚油酸、100μg/ml亚麻酸、0.63μg/ml黄体酮、1610μg/ml腐胺、1.44μg/ml亚硒酸钠和0.20μg/ml三碘甲状腺氨酸。

9、进一步，本发明还提供用于诱导分化定向内胚层细胞的无动物源培养基，所述培养基包括上述无动物源补充剂，具体的，所述诱导分化定向内胚层细胞的无动物源培养基包括定向内胚层培养基1和定向内胚层培养基2，所述定向内胚层培养基1以mcdb131培养基为基础培养基，包括以下成分：

10、2～3.5μg/ml生物素、0.8～1.5μg/ml的dlα-生育酚醋酸酯、3.5～5μg/ml人重组胰岛素、4～6μg/ml人转铁蛋白、0.01～0.05μg/ml皮质酮、10～20μg/mld-半乳糖、0.8～1.5μg/ml盐酸乙醇胺、0.8～1.5μg/ml还原型谷胱甘肽、1.5～3μg/ml左旋肉碱盐酸盐、0.8～1.5μg/ml亚油酸、0.8～1.5μg/ml亚麻酸、0.005～0.008μg/ml黄体酮、15～20μg/ml腐胺、0.01～0.02μg/ml亚硒酸钠和0.001～0.005μg/ml三碘甲状腺氨酸；

11、1～2mm谷氨酰胺、50～100u/ml青霉素、50～100μg/ml链霉素、3～5mm葡萄糖、80～120ng/ml tgf-β激活剂、0.2～0.3mm维生素c、5～8μm wnt信号通路激活剂、40～60nmpi3k/mtor抑制剂和8～15μm rock抑制剂。

12、进一步，优选所述tgf-β激活剂为activin a；所述wnt信号通路激活剂为chir-99021；所述pi3k/mtor抑制剂为pi-103；所述rock抑制剂为y27632。

13、优选所述定向内胚层培养基1的组成为：以mcdb131培养基为基础培养基；以及以下终浓度的成分：

14、2.5μg/ml生物素、1μg/ml的dlα-生育酚醋酸酯、4μg/ml人重组胰岛素、5μg/ml人转铁蛋白、0.02μg/ml皮质酮、15μg/mld-半乳糖、1μg/ml盐酸乙醇胺、1μg/ml还原型谷胱甘肽、2μg/ml左旋肉碱盐酸盐、1μg/ml亚油酸、1μg/ml亚麻酸、0.0063μg/ml黄体酮、16.1μg/ml腐胺、0.0144μg/ml亚硒酸钠和0.002μg/ml三碘甲状腺氨酸；

15、2mm的谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、4.5mm葡萄糖、100ng/mlactivin a、0.25mm维生素c、6μm chir-99021、50nm pi-103和10μm y27632。

16、所述定向内胚层培养基2以mcdb131培养基为基础培养基，包括以下成分：

17、2～3.5μg/ml生物素、0.8～1.5μg/mldlα-生育酚醋酸酯、3.5～5μg/ml人重组胰岛素、4～6μg/ml人转铁蛋白、0.01～0.05μg/ml皮质酮、10～20μg/mld-半乳糖、0.8～1.5μg/ml盐酸乙醇胺、0.8～1.5μg/ml还原型谷胱甘肽、1.5～3μg/ml左旋肉碱盐酸盐、0.8～1.5μg/ml亚油酸、0.8～1.5μg/ml亚麻酸、0.005～0.008μg/ml黄体酮、15～20μg/ml腐胺、0.01～0.02μg/ml亚硒酸钠和0.001～0.005μg/ml三碘甲状腺氨酸；

18、1～2mm谷氨酰胺、50～100u/ml青霉素、50～100μg/ml链霉素、3～5mm葡萄糖、40～60ng/ml tgf-β激活剂、0.2～0.3mm维生素c。

19、优选所述定向内胚层培养基2的组成为：以mcdb131培养基为基础培养基；以及以下终浓度的成分：

20、2.5μg/ml生物素、1μg/ml的dlα-生育酚醋酸酯、4μg/ml人重组胰岛素、5μg/ml人转铁蛋白、0.02μg/ml皮质酮、15μg/mld-半乳糖、1μg/ml盐酸乙醇胺、1μg/ml还原型谷胱甘肽、2μg/ml左旋肉碱盐酸盐、1μg/ml亚油酸、1μg/ml亚麻酸、0.0063μg/ml黄体酮、16.1μg/ml腐胺、0.0144μg/ml亚硒酸钠和0.002μg/ml三碘甲状腺氨酸；

21、2mm的谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、4.5mm葡萄糖、50ng/mlactivin a、0.25mm维生素c。

22、进一步，所述定向内胚层培养基1和定向内胚层培养基2可以由无动物源浓缩补充剂制得，所述定向内胚层培养基1的组成为：

23、以mcdb131培养基为基础培养基，包括以下成分：

24、100×无动物源浓缩补充剂、1～2mm谷氨酰胺、50～100u/ml青霉素、50～100μg/ml链霉素、3～5mm葡萄糖、80～120ng/ml tgf-β激活剂、0.2～0.3mm维生素c、5～8μm wnt信号通路激活剂、40～60nm pi3k/mtor抑制剂和8～15μm rock抑制剂。

25、所述定向内胚层培养基1的组成为：

26、以mcdb131培养基为基础培养基，包括以下成分：

27、100×无动物源浓缩补充剂、1～2mm谷氨酰胺、50～100u/ml青霉素、50～100μg/ml链霉素、3～5mm葡萄糖、40～60ng/ml tgf-β激活剂、0.2～0.3mm维生素c。

28、本发明还提供所述无动物源培养基在诱导分化定向内胚层细胞中的应用。

29、进一步，本发明还提供一种将多能干细胞诱导分化为定向内胚层细胞的培养方法，所述方法为，采用所述用于诱导分化定向内胚层细胞的无动物源培养基，对多能干细胞进行培养，将其分化为定向内胚层细胞。

30、本发明中，多能干细胞为人诱导多能干细胞。

31、进一步，所述方法为，多能干细胞用定向内胚层培养基1培养1天，然后换成定向内胚层培养基2培养3天，诱导分化得到定向内胚层细胞。

32、进一步，所述在培养箱中培养，培养条件为37℃，5％co2。

33、进一步，用定向内胚层培养基2培养3天时，每天更换培养基。

34、进一步，所述方法中，多能干细胞按以下方法扩增培养得到：

35、多能干细胞用mtesr1培养基于37℃培养至细胞融合度达80-90％，消化成单细胞，用含有10μm y27632的mtesr1干细胞培养基重悬后接种于载体，一天后开始诱导分化。

36、所述载体为培养板。

37、本发明的有益效果在于：

38、本发明首次提供了一种无血清蛋白无动物源的补充剂以及包括所述无动物源补充剂的培养基，补充剂和培养基不含血清且无动物源成份，与activin a和chir99021等小分子联合使用可高效诱导多能干细胞定向内胚层分化，分化效率高达95％。本发明克服了传统补充剂因成份不明确和含动物源等因素造成生物制品安全隐患，可用于临床产品。而且本发明的无动物源补充剂兼具配方精简、易配制、成本低廉和质量更稳定等优势，在临床研究上有较大的应用前景，有利于产品的商业化以及大批量生产应用。