纳米材料致突变性评价方法及其应用与流程

本发明涉及材料致突变性评估，特别是涉及一种纳米材料致突变性评价方法及其应用。

背景技术：

1、纳米材料是纳米级结构材料的简称，纳米颗粒的尺寸最多不超过100nm。广义的纳米材料是指微观结构至少在一维方向上不超过100nm的固体超细材料。纳米材料独特的小尺寸效应和物理化学特性使其在生物医药领域具有很好的应用前景。

2、然而，随着纳米材料产品大量涌入日常生活，人体长期暴露于纳米材料环境下的安全风险已引起广泛关注。药品、化妆品、染料等产品中的纳米成分均存在脱落的风险。当颗粒物粒径为5～10μm时可进入鼻腔和咽喉，较小的pm 2.5(粒径小于2.5μm)颗粒会进入气管、支气管，直接损害肺泡，而粒径更小的纳米颗粒，其危害性更大，足以穿透人体的“生理屏障”对人体造成严重损伤。

3、遗传毒性评价用于预测受试物的人体致癌性风险，是药品、化妆品、食品添加剂、医疗器械等进入临床试验及上市前必须开展的研究项目。纳米材料可与细胞中特定的细胞器相互作用；也可以穿过核膜，对细胞遗传物质产生直接或间接的作用，介导氧化应激或炎症等作用机制诱发染色体或dna断裂，具有致癌性风险。

4、目前，使用营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌开展的细菌回复性突变试验(ames试验)是公认的可靠且简便的致突变性评价方法。ames试验对引起大鼠肿瘤化合物的预测一致度为69％，对引起恒河猴肿瘤化合物的预测一致度高达87.5％。然而，经济与合作组织(oecd)对2002～2010年间17项纳米材料ames试验结果进行了汇总，发现其中15项结果均为阴性，提示结果存在不准确的可能。

5、因此，目前缺乏适宜对纳米材料致突变性进行评价的方法，难以判断纳米材料是否导致基因突变。

技术实现思路

1、基于此，有必要针对纳米材料缺乏适宜致突变性评价方法的问题，提供一种纳米材料致突变性评价方法，能够准确评价纳米材料的致突变性。

2、一种纳米材料致突变性评价方法，先对纳米材料受试物和菌株进行酸化预处理，再进行致突变性评价实验，所述酸化预处理步骤为：将菌株以氯化钠暴露液重悬，加入纳米材料受试物，得到酸化暴露体系，放置反应，中和所述纳米材料受试物表面的负电荷和/或使纳米材料受试物表面呈正电性，得到待测溶液。

3、本发明人在前期调查研究中发现，从试验角度来看，传统ames试验体系不适合对纳米材料进行评价，可能原因包括以下几点：1)纳米材料颗粒在琼脂中快速聚集，不利于纳米材料与细菌菌株的充分接触；2)试验所用的测试菌常为革兰氏阴性菌，其等电点为ph4～5，而培养体系ph一般大于细菌等电点，测试细菌细胞壁还含有大量磷酸基，带负电荷，而多数纳米材料携带负电，呈碱性，因此纳米材料与细菌之间存在静电排斥，难以充分接触。

4、在上述研究基础上，本发明人提出，使用氯化钠预暴露溶液对试验体系进行酸化预处理，中和纳米材料表面负电荷，或使其带上正电，减少细菌与纳米材料之间的静电排斥，从而避免纳米材料与细菌之间存在静电排斥导致评价结果不准确的问题。

5、在其中一个实施例中，所述纳米材料表面呈负电性。例如为了避免纳米材料在体内聚集、在血液中吸附过多蛋白或其他小分子的目的，在合成时常通过表面官能团设计使其带负电的生物医药纳米材料(即毒理学评价的对象)等。

6、在其中一个实施例中，所述氯化钠暴露液为10±5mm的氯化钠水溶液；所述酸化暴露体系中，所述菌株的密度为5×108个/ml～5×109个/ml(即od600约为0.4-0.6)。可以理解的，当氯化钠暴露液浓度过低，无法充分中和所述纳米材料受试物表面的负电荷，而当氯化钠暴露液浓度过高，又可能对菌株生长产生不利影响，采用上述的暴露液浓度和菌株密度相配合，具有较好的预处理效果，可以使菌株充分与纳米材料接触、反应，得到更为准确的评估结果。

7、在其中一个实施例中，所述酸化暴露体系通过以下方法得到，将菌株以氯化钠暴露液重悬得到菌液(通常控制此时od600为2-3)，取所述菌液，以氯化钠暴露液稀释100±20倍，再加入纳米材料受试物，即得。

8、在其中一个实施例中，所述菌株通过以下方法得到：取菌液，离心分离去除溶液，并以氯化钠暴露液清洗1-3次，去除清洗液，即得。

9、在其中一个实施例中，所述放置反应的条件为：在37±2℃下恒温100～120rpm振荡培养30±10min。

10、在其中一个实施例中，所述菌株选自：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株。

11、在其中一个实施例中，所述菌株选自：ta98、ta100菌株。其中，ta98可检出移码突变，ta100可检出碱基置换。且以ta98、ta100菌株进行测试，其测试结果可靠性更高。

12、在其中一个实施例中，当所述纳米材料为sio2，所述菌株选自：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株ta98；当所述纳米材料为tio2，所述菌株选自：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株ta100。以上述菌株检测对应材料，具有较优的测试效果。

13、在其中一个实施例中，所述致突变性评价实验采用液态细胞培养体系进行，具体包括以下步骤：

14、回复突变试验：取完成酸化预处理的待测溶液，建立液态非代谢活化培养体系和液态代谢活化培养体系进行试验，其中，非代谢活化试验方法为：取所述待测溶液，加入液态非代谢活化选择性生长培养基，得到测试组，同时设置阴性对照组，在小孔板中进行细胞培养；代谢活化试验方法为：取所述待测溶液，加入液态酸化代谢活化选择性生长培养基，得到测试组，同时设置阴性对照组，在小孔板中进行细胞预培养，预培养预定时间后，再补充所述液态酸化代谢活化选择性培养基，继续培养；

15、致突变性评价：向上述非代谢活化培养体系和代谢活化培养体系中加入指示剂，对培养体系的显色情况进行分析，得到纳米材料受试物的致突变性评价结果。

16、可以理解的，选择液态培养体系，可促进纳米材料与菌株进一步的充分接触，提高评价准确性。且采用小孔板进行实验，可减少受试物用量，如为常规平皿试验的1/20，还可同时检测4～6个化合物，实现高效评价筛选。

17、在其中一个实施例中，所述指示剂为溴麝香草酚蓝；

18、所述非代谢活化试验方法为：取所述待测溶液0.5ml，加入液态非代谢活化选择性生长培养基19.5ml，混匀后加入小孔板，套上密封袋，在37±2℃下培养5±2天；

19、所述代谢活化试验方法为：取所述待测溶液0.5ml，加入液态酸化代谢活化选择性生长培养基4.5ml，混匀后加至小孔板，置37℃条件下培养2±0.5h后，每孔再添加0.15ml液态酸化代谢活化选择性培养基，套上密封袋，继续在37±2℃下培养5±2天。

20、在其中一个实施例中，所述液态非代谢活化选择性生长培养基包含以下比例的成分：d-mhalf盐溶液200ml,20±2％的葡萄糖溶液2ml,0.1±0.01％的组氨酸1ml和0.1±0.01％的生物素0.04ml；

21、所述液态酸化代谢活化选择性生长培养基包含以下比例的成分：10±1mm氯化钠溶液60ml,20±2％的葡萄糖溶液0.8ml,s9混合液20±2ml,0.1±0.01％的组氨酸0.02ml和0.1±0.01％的生物素0.8ml；

22、所述s9混合液包含以下体积比的成分：33.5％的灭菌注射用水，50％的0.2±0.2mpna buffer(ph 7.4),4％的0.1±0.01m nadp na2,0.5％的1±0.1m g-6-p na2，2％的1.65±0.16mkcl、0.4±0.04m mgcl2和10％的大鼠肝微粒体s9；

23、所述液态代谢活化选择性培养基包含以下体积比的成分：d-m half盐溶液200ml,20±2％葡萄糖溶液8ml。

24、在其中一个实施例中，所述待测溶液中纳米材料受试物的最大剂量通过以下方法得到：配置若干浓度的受试物溶液，加入至毒性试验选择性生长培养基中，进行细胞培养后观察培养体系颜色和/或细胞生长情况，以细胞生长不受抑制的最大剂量为预定剂量上限。

25、在其中一个实施例中，所述毒性试验选择性生长培养基包含以下比例的成分：d-mfull盐溶液100ml,20±2％的葡萄糖溶液8ml,0.1±0.01％的组氨酸0.04ml，0.1±0.01％的生物素1.6ml,600±60μg/ml的溴麝香草酚蓝0.05ml和1ml测试溶液。所述测试溶液中菌株密度为5×108个/ml～5×109个/ml。

26、在其中一个实施例中，所述致突变性评价的标准包括定性标准和/或定量标准；所述定性标准为：培养体系呈现黄色为阳性；培养体系呈现绿色为阴性；培养体系呈现黄绿色时，非代谢活化培养体系为阴性，代谢活化培养体系为阳性；

27、所述定量标准为：检测培养体系分别在波长为492nm和623nm时的吸光度，计算两者差值作为酶标仪读数结果，当差值≥0.20且培养体系呈黄色，判定为阳性；当差值≤0.18且培养体系呈绿色，判定为阴性，当差值在0.18-0.20之间且培养体系呈黄绿色，非代谢活化培养体系为判定为阴性，代谢活化培养体系为阳性；

28、致突变性评价的判定方法为：对测试组与阴性对照组的回复突变孔之间的差异使用单因素方差分析法对数据显著性进行检验，当p<0.05时认为差异有统计学意义，且同时存在剂量效应相关性时，判定该剂量的受试物具有致突变性。

29、在其中一个实施例中，所述致突变性评价的标准还包括验证标准：观察显微镜下培养体系中菌落生长情况，当培养体系颜色与实际菌落生长情况不符时，以显微镜下观察结果为准。

30、在其中一个实施例中，所述纳米材料致突变性评价方法还包括质控步骤：建立所述非代谢活化培养体系和代谢活化培养体系的同时设置阳性对照试验，以菌斑生长为阳性结果，无菌斑生长为阴性结果，当阴性对照组细胞培养板中发生回复突变率≤10/48孔，阳性对照组细胞培养板中回复突变率＞25/48孔时，判定致突变性评价结果可信；

31、所述非代谢活化培养体系的阳性对照物为2-(2-呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺(af-2)，所述代谢活化培养体系的阳性对照物为2-氨基蒽(2-aa)。

32、在其中一个实施例中，所述2-(2-呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺的终浓度为2-20ng/ml，所述2-氨基蒽的终浓度为125-250ng/ml；阴性对照物为水或dmso。

33、本发明还公开了一种纳米材料遗传毒性的评估方法，具体为以上述的评价方法进行评估。

34、可以理解的，可通过致突变性，评估其遗传毒性。

35、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

36、本发明的纳米材料致突变性评价方法，使用氯化钠暴露液对试验体系进行酸化预处理，中和纳米材料表面负电荷，或使其带上正电，减少细菌与纳米材料之间的静电排斥，从而避免纳米材料与细菌之间存在静电排斥导致评价结果不准确的问题。

37、并且，进一步的，本发明选择液态培养体系进行评价，可促进纳米材料与菌株进一步的充分接触，提高评价准确性。同时采用小孔板进行实验，能够减少受试物使用量，如可减少受试物用量为常规试验的1/20。并且，还可在同时检测多个(如5-10个等)受试物的高通量检测基础上，减少检测每个受试物检测的试剂和耗材用量。