中和呼吸道合胞病毒的C-型单域抗体及应用的制作方法

本发明涉及生物医药工程，具体涉及一种中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体及应用。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒呈季节性流行，可经呼吸道和密切接触传播，主要感染婴幼儿、老人以及免疫力低下人群，导致急性呼吸道感染、肺炎，甚至死亡。然而至今无有效的疫苗和特异性治疗药物，临床则是使用利巴韦林(非特异性、副作用大)，或预防性注射palivizumab单抗(价格昂贵、中和活性较弱)以达到抗病毒的目的，亟待研发新一代药物。

技术实现思路

1、针对现有技术中的问题，本申请提供了一种中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体及应用。

2、本发明从人源igg1的ch2结构域改造后的ch2-m01sm2为骨架的噬菌体表面展示文库中，以呼吸道合胞病毒囊膜蛋白f(f蛋白)为抗原，经过筛选和后续改造，得到候选克隆。我们用大肠杆菌原核表达并纯化所得到的克隆蛋白，并对其生物学特异性及中和活性进行了鉴定，最终获得一种能够中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体bbt-vc001-1(也可称为c-型纳米抗体bbt-vc001-1)，可以用于呼吸道合胞病毒的预防和治疗。

3、bbt-vc001-1具有三个loop区，三个loop区loop 1、loop 2和loop 3的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.3和seq id no.6所示。

4、bbt-vc001-1中编码所述三个loop区loop 1、loop 2和loop 3的核苷酸序列分别如seq id no.39、seq id no.40和seq id no.41所示。

5、bbt-vc001-1的氨基酸序列如seq id no.10所示，核苷酸序列如seq idno.42所示。

6、本发明提供的上述针对rsv f蛋白的c-型单域抗体bbt-vc001-1，是通过以下方法得到：首先构建以ch2(图1)为骨架的噬菌体展示文库，然后以rsv f蛋白为抗原，经过筛选和优化得到克隆bbt-vc001-1。表达纯化该克隆(图2)，并对其进行鉴定分析。通过elisa对bbt-vc001-1的结合活性进行了鉴定，实验结果表明bbt-vc001-1能够与rsv f蛋白特异性相结合(图3)。间接免疫荧光实验表明，bbt-vc001-1同样可以与细胞膜表面呈天然构象的f蛋白相结合(图4)。另外，细胞水平抗病毒实验表明，bbt-vc001-1具有高效的抗呼吸道合胞病毒作用(图5)。动物水平实验表明，通过肺部雾化给与bbt-vc001-1抗体可对rsv感染balb/c小鼠起到预防和治疗作用(图6)。

7、本发明中bbt-vc001-1抗体的氨基酸序列点突变体命名为2c、m17、zh1、b5、m2、m3、m4、m5、m6、m7、m8、m9、m10、m11、ks、2h、2h-ks、f11、f11-ks、2h-f11、2h-f11-ks具有与bbt-vc001-1抗体类似的结合活性及抗病毒活性(图7-10)。同时，将bbt-vc001-1的三个loop区替换到其他抗体片段的相应部位(所得抗体为higg1 ch2-com、higg2 ch2-com、higg3 ch2-com、higg4 ch2-com)，依然可以获得具有结合活性和抗病毒活性的组合体(图11)。将bbt-vc001-1与多肽(abd和16l)或者蛋白(vh)连接做成融合多肽或者融合蛋白，其结合抗原的活性保持不变(图12)，以上所有突变体和抗体的序列编号列在文末表1中。

8、本发明还揭示了上述中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体在制备针对呼吸道合胞病毒的预防和治疗药物、检测探针、融合多肽、融合蛋白、偶联抗体中的应用。本发明的中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体可在制备呼吸道合胞病毒防治相关的滴鼻剂、喷鼻剂、雾化药、肌肉注射制剂、静脉注射制剂中应用，优选地，各配方中的浓度范围在0.01ng/ml至1g/ml。

9、本发明使用的术语“c-型单域抗体”指以抗体恒定区ch2结构域为骨架的一类抗体。相对于全长单克隆抗体，单域抗体具有更好的组织渗透性，且能够优势结合空间上存在位阻效应的抗原表位。

10、本发明的有益效果为：本发明的c-型单域抗体是针对rsv f蛋白的抗体，能够抑制病毒侵入细胞，可用于rsv的预防、治疗和诊断，以及用于进一步研究rsv感染中的机制。相对于全长单抗(分子量～150kd)，本发明的c-型单域抗体分子量较小(12～15kd)，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力；它可在包括原核、酵母、哺乳动物细胞在内的多个表达系统内进行表达，生产成本低、周期短；c-型单域抗体给药途径广，能够通过滴鼻、喷鼻、喷雾、雾化吸入、肌肉注射、皮下注射、静脉注射等方式给药。

技术特征：

1.一种中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体，其特征在于：所述c-型单域抗体以ch2结构域为骨架，它具有三个loop区：loop 1、loop 2和loop 3，

2.根据权利要求1所述中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体，其特征在于：loop 1、loop 2和loop 3的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.3和seq id no.6所示。

3.根据权利要求1所述中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体，其特征在于：所述c-型单域抗体的氨基酸序列选自seq id no.10-35中任一项。

4.权利要求1～3所述的中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体在制备针对呼吸道合胞病毒的预防和治疗药物、检测探针、融合多肽、融合蛋白、偶联抗体中的应用。

5.权利要求1～3所述的中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体在制备呼吸道合胞病毒防治相关的滴鼻剂、喷鼻剂、雾化药、注射制剂中的应用。

6.一种呼吸道合胞病毒抗体融合多肽，其特征在于，所述抗体融合多肽的氨基酸序列如seq id no.36所示。

7.一种呼吸道合胞病毒抗体融合多肽，其特征在于，所述抗体融合多肽的氨基酸序列如seq id no.37所示。

8.一种呼吸道合胞病毒抗体融合蛋白，其特征在于，所述抗体融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.38所示。

9.根据权利要求2所述中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体，其特征在于：编码所述loop 1、loop 2和loop 3的核苷酸序列分别如seq id no.39、seq idno.40和seq id no.41所示。

10.根据权利要求3所述中和呼吸道合胞病毒的c-型单域抗体，其特征在于：编码所述c-型单域抗体的核苷酸序列如seq id no.42所示。

技术总结
本发明公开了一种中和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)的C‑型单域抗体及应用。本发明的C型单域抗体是针对RSV F蛋白的抗体，能够抑制病毒侵入细胞，可用于RSV的预防、治疗和诊断，以及用于进一步研究RSV感染中的机制。相对于全长单抗，本发明的C型单域抗体分子量较小，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力；它可在包括原核、酵母、哺乳动物细胞在内的多个表达系统内进行表达，生产成本低、周期短；C型单域抗体给药途径广，能够通过滴鼻、喷鼻、喷雾、雾化吸入、肌肉注射、静脉注射、皮下注射等方式给药。

技术研发人员：龚睿,寻广谨,张海伟
受保护的技术使用者：武汉班科生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16