肌红蛋白突变体及其在催化卡宾转移反应中的应用

本发明涉及生物，特别是涉及肌红蛋白突变体及其在催化卡宾转移反应中的应用。

背景技术：

1、自然界的植物、微生物中有大量具有生物活性的天然化合物，这些天然化合物是药物分子的重要来源。天然化合物分子的结构空间有限，在药物筛选的过程中往往需要通过合成化学的方法对其进行修饰，扩展结构的多样性。合成生物学的发展，推动可生物酶的发展，通过设计催化新反应的酶，直接对现有天然化合物分子进行选择性修饰，可以实现后期官能团转化。

2、目前大量的药物是从天然化合物经过修饰而来，且许多包含环丙烷基的天然和非天然化合物都具有生物活性，这类化合物大量用作有机合成材料及中间体。紫苏醇、香芹醇、柠檬烯等多种天然化合物中含有碳碳双键，可以通过卡宾转移反应转化为环丙烷，并引入不同取代基团，从而实现天然化合物的快速衍生化。

3、肌红蛋白(myoglobin,mb)是一种卡宾转移酶，可以以简单的端烯化合物，如4-氯苯乙烯、3-乙烯基噻吩等小分子芳香类化合物为底物进行卡宾转移反应。肌红蛋白是一种结合氧气的蛋白质，其底物结合口袋小，目前没有报道以结构复杂的单萜天然化合物为底物的卡宾转移反应。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供肌红蛋白突变体及其在催化卡宾转移反应中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的肌红蛋白突变体具有催化卡宾转移反应的活性，可以催化含端烯的单萜天然化合物生成环丙基产物。

2、本发明着眼于天然化合物的后期官能团转化这一生物活性分子和药物候选化合物创制中的重要过程，通过蛋白质工程设计并制备得到两种肌红蛋白突变体，拓展肌红蛋白催化卡宾转移反应的底物谱，构建生物催化体系，实现天然化合物的衍生。

3、基于此，本发明提供了如下方案：

4、本发明提供一种肌红蛋白突变体，氨基酸序列如seq id no.7或seq id no.9所示。

5、本发明还提供上述的肌红蛋白突变体的编码基因，核苷酸序列如seq id no.8或seq id no.10所示；

6、当所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示时，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.8所示；

7、当所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.9所示时，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.10所示。

8、本发明还提供一种重组微生物菌株，其特征在于，包含上述的编码基因。

9、本发明还提供上述的编码基因或重组微生物菌株在制备上述的肌红蛋白突变体中的应用。

10、本发明还提供上述的重组微生物菌株在催化含端烯的单萜天然化合物进行卡宾转移反应中的应用。

11、进一步地，所述含端烯的单萜天然化合物为香芹醇、香芹酮、紫苏醇、柠檬烯、罗勒烯或乙酸香芹酯。

12、本发明还提供上述的肌红蛋白突变体在催化含端烯的单萜天然化合物进行卡宾转移反应中的应用。

13、进一步地，当所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示时，所述含端烯的单萜天然化合物为香芹醇、香芹酮或乙酸香芹酯；当所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.9所示时，所述含端烯的单萜天然化合物为香芹醇、香芹酮、紫苏醇、柠檬烯、罗勒烯或乙酸香芹酯。

14、本发明还提供一种式(i)-(ⅲ)任一项所示化合物的合成方法，包括利用上述的肌红蛋白突变体或重组微生物菌株，催化所述化合物对应的底物进行卡宾转移反应，生成所述化合物的步骤；

15、

16、式(i)所示化合物对应的底物为香芹醇；

17、式(ⅱ)所示化合物对应的底物为香芹酮；

18、式(ⅲ)所示化合物对应的底物为乙酸香芹酯。

19、本发明还提供一种式(iv)-(vi)任一项所示化合物的合成方法，包括利用肌红蛋白突变体或重组微生物菌株，催化所述化合物对应的底物进行卡宾转移反应，生成所述化合物的步骤；

20、

21、式(iv)所示化合物对应的底物为紫苏醇；

22、式(v)所示化合物对应的底物为柠檬烯；

23、式(vi)所示化合物对应的底物为罗勒烯；

24、所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.9；所述重组微生物菌株包含如seq id no.8或seq id no.10所示的基因序列。

25、本发明公开了以下技术效果：

26、本发明从肌红蛋白突变体mb(h64v，v68a)出发，设计并制备得到了mb(v64a,t67a,v68a)和mb(r45a,v64a,t67a,v68a)两个突变体，经验证，这两个突变体具有催化卡宾转移反应的活性，可以催化含端烯的单萜天然化合物生成环丙基产物。

27、本发明通过构建蛋白反应体系和全细胞反应体系进行卡宾转移催化活性验证，结果发现，两种反应体系都可以催化含端烯的单萜天然化合物进行卡宾转移反应，其中，全细胞反应体系的催化转化率更高，且全细胞反应体系可以催化更多种类底物(紫苏醇、柠檬烯和罗勒烯)进行卡宾转移反应。

28、本发明成功合成了六个目的产物，其中2-(5-羟基-4-甲基环己-3-烯基)-2-甲基环丙烷-1-甲酸乙酯、2-[4-(羟基甲基)环己-3-烯基]-2-甲基环丙烷-1-甲酸乙酯和2-(2,5-二甲基己-1,4-二烯基)环丙烷-1-甲酸乙酯三个目的产物为第一次合成，另外2-甲基-2-(4-甲基-5-氧亚基环己-3-烯基)环丙烷-1-甲酸乙酯、2-甲基-2-(4-甲基环己-3-烯基)环丙烷-1-甲酸乙酯和2-甲基-2-[(5r)-4-甲基环己-3-烯基]环丙烷-1-甲酸乙酯三个目的产物为第一次通过肌红蛋白催化合成，与基于铱卟啉的卡宾转移酶相比，成本更低。

技术特征：

1.一种肌红蛋白突变体，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.7或seq id no.9所示。

2.一种如权利要求1所述的肌红蛋白突变体的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.8或seq id no.10所示；

3.一种重组微生物菌株，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。

4.一种如权利要求2所述的编码基因或权利要求3所述的重组微生物菌株在制备如权利要求1所述的肌红蛋白突变体中的应用。

5.一种如权利要求3所述的重组微生物菌株在催化含端烯的单萜天然化合物进行卡宾转移反应中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含端烯的单萜天然化合物为香芹醇、香芹酮、紫苏醇、柠檬烯、罗勒烯或乙酸香芹酯。

7.一种如权利要求1所述的肌红蛋白突变体在催化含端烯的单萜天然化合物进行卡宾转移反应中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，当所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示时，所述含端烯的单萜天然化合物为香芹醇、香芹酮或乙酸香芹酯；当所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.9所示时，所述含端烯的单萜天然化合物为香芹醇、香芹酮、紫苏醇、柠檬烯、罗勒烯或乙酸香芹酯。

9.一种式(i)-(ⅲ)任一项所示化合物的合成方法，其特征在于，包括利用权利要求1所示的肌红蛋白突变体或权利要求3所述的重组微生物菌株，催化所述化合物对应的底物进行卡宾转移反应，生成所述化合物的步骤；

10.一种式(iv)-(vi)任一项所示化合物的合成方法，其特征在于，包括利用肌红蛋白突变体或重组微生物菌株，催化所述化合物对应的底物进行卡宾转移反应，生成所述化合物的步骤；

技术总结
本发明公开了肌红蛋白突变体及其在催化卡宾转移反应中的应用，涉及生物技术领域。该肌红蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示。本发明还提供该肌红蛋白突变体在催化含端烯的单萜天然化合物进行卡宾转移反应中的应用。本发明着眼于天然化合物的后期官能团转化这一生物活性分子和药物候选化合物创制中的重要过程，通过蛋白质工程设计并制备得到两种肌红蛋白突变体，拓展肌红蛋白催化卡宾转移反应的底物谱，构建生物催化体系，实现天然化合物的衍生。

技术研发人员：于洋,孙一洋,袁飞燕
受保护的技术使用者：北京理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16