一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法、重组大肠杆菌及应用

本发明属于生物工程，尤其是一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法、重组大肠杆菌及应用。

背景技术：

1、到目前为止，已经发现了100多种不同类型的rna修饰，这些修饰大多存在于rrna、trna和snrna中。最常见和最早发现的修饰之一是从尿苷到假尿苷的异构化。近年来，随着人们对rna疫苗的关注和研究，将假尿苷及其类似物替换尿苷加入mrna，能提高mrna的稳定性并增强其翻译能力，可以解决mrna药物容易被免疫系统识别而被清除、产生免疫副反应的问题。假尿苷作为一种rna的代谢产物，具有仅从肾脏排泄的特点，在临床医学上可用于监测肿瘤的发生、发展及肾病的诊治。假尿苷具有十分重要的应用价值，随着假尿苷市场需求量的不断扩大，使得人们在假尿苷的合成方法上开始投入了越来越多的研究。

2、1961年，首次报道了化学合成假尿苷的方法，但总收率仅为2％，且产物为α和β异构体的混合。目前，假尿苷的生产方法主要有化学合成法、化学-酶法和酶催化法。李静简等(202210798651.4)以2，3，5-三苄氧基-d-核糖酸-1，4-内酯与2，4-二烷氧基-5-溴嘧啶为原料通过加成、还原、脱保护基等反应后得到假尿苷；金峰等(202210473532.1)以d-核糖和尿嘧啶为起始反应物经有机溶剂通过加成、缩合、脂肪酶拆分、脱保护基等反应后得到假尿苷，但两种化学合成方法均存在步骤繁琐、收率较低的问题。肖聪等(2021111581013.9)使用化学-酶法合成假尿苷，先化学合成5-磷酸核糖，再用假尿苷-5-磷酸糖苷酶催化5-磷酸核糖与尿嘧啶合成假尿苷单磷酸，最后去磷酸化得到假尿苷，产量为7.9g/l，转化率为51％。陈伟等(202111581013.9)将来自于streptomyces sp.id38640中的假尿苷合成基因pumh、pumj和pumd克隆至大肠杆菌体内，96h可转化10g/l肌苷产7.2g/l假尿苷。朱文娟等(202310168205x)利用重组大肠杆菌分别表达尿苷磷酸化酶udp、嘌呤核苷磷酸化酶deod、磷酸戊糖变位酶deob以及假尿苷-5-磷酸糖苷酶yein，再将酶液混合，24h可转化尿苷产生1.16g/l假尿苷，转化率为95％。但以上方法普遍存在步骤复杂繁琐、生产成本高、生产效率低、产品难于回收纯化等缺点，导致产品售价较高，限制了其在生物和医药领域中的大规模应用。因此，迫切需要开发廉价的、适合工业化放大的假尿苷生产工艺。

3、全细胞生物催化法主要借助细胞内的酶进行催化，成为介于发酵法与纯酶催化法之间的生物技术。该方法不仅可以实现酶的级联反应，提高酶的催化效率，更能大大减少酶的纯化过程，使生产成本得到有效控制。因而，胞内的酶在细胞膜或细胞壁的保护下，可具备更高的稳定性与更长的半衰期，易实现催化的高效性。利用全细胞催化法生产核苷类产品是近年来研究的热点。本发明在大肠杆菌e.coli mg1655中构建了新颖的酶催化反应路线，实现了以尿苷或胞苷为底物全细胞催化制备假尿苷新工艺。

4、通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法、重组大肠杆菌及应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种能够全细胞催化制备假尿苷的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌e.coli mg1655中过表达假尿苷-5-磷酸糖苷酶，过表达核糖激酶，过表达核糖核苷水解酶，过表达胞嘧啶脱氨酶，过表达核苷渗透酶，不表达假尿苷转运蛋白，获得重组大肠杆菌。

4、进一步地，所述假尿苷-5-磷酸糖苷酶为大肠杆菌yein基因编码的蛋白，大肠杆菌yein基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述核糖激酶为大肠杆菌rbsk基因编码的蛋白，大肠杆菌rbsk基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；

6、所述核糖核苷水解酶为大肠杆菌riha基因或大肠杆菌rihb基因或大肠杆菌rihc基因编码的蛋白，大肠杆菌riha基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，大肠杆菌rihb基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，大肠杆菌rihc基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；优选大肠杆菌riha基因编码的蛋白；

7、所述胞嘧啶脱氨酶为大肠杆菌coda基因编码的蛋白，大肠杆菌coda基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；

8、所述核苷渗透酶为大肠杆菌nupc基因编码的蛋白，大肠杆菌nupc基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；

9、所述假尿苷转运蛋白为大肠杆菌psut基因编码的蛋白，大肠杆菌psut基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

10、进一步地，所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：

11、(1)将核苷酸序列如seq id no.1所示的假尿苷-5-磷酸糖苷酶基因yein与启动子ptrc的融合片段ptrc-yein连接到质粒ptrc99aδlaci中获得质粒p1；

12、(2)将核苷酸序列如seq id no.2所示的核糖激酶基因rbsk与启动子ptrc的融合片段ptrc-rbsk连接到质粒p1中获得质粒p2；

13、(3)将核苷酸序列如seq id no.3所示的核糖核苷水解酶基因riha与启动子ptrc的融合片段ptrc-riha、核苷酸序列如seq id no.4所示的核糖核苷水解酶基因rihb与启动子ptrc的融合片段ptrc-rihb、核苷酸序列如seq id no.5所示的核糖核苷水解酶基因rihc与启动子ptrc的融合片段ptrc-rihc分别连接到质粒p2中获得质粒p3-p5；

14、(4)将核苷酸序列如seq id no.6所示的胞嘧啶脱氨酶基因coda与启动子ptrc的融合片段ptrc-coda连接到质粒p3中获得质粒p6；

15、(5)将核苷酸序列如seq id no.7所示的核苷渗透酶基因nupc与启动子ptrc的融合片段ptrc-nupc整合在出发菌株的yjgx假基因位点，获得重组菌株ψ1；

16、(6)将核苷酸序列如seq id no.8所示的假尿苷转运蛋白基因psut从重组菌株ψ1中敲除或失活，获得重组菌株ψ2；

17、(7)将(3)和(4)中构建的质粒p3-p6分别电转化到ψ2中获得重组菌株ψ3-ψ6。

18、如上所述的方法在假尿苷制备中的应用，

19、一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法，所述方法在大肠杆菌e.coli mg1655中过表达假尿苷-5-磷酸糖苷酶，过表达核糖激酶，过表达核糖核苷水解酶，过表达胞嘧啶脱氨酶，过表达核苷渗透酶，不表达假尿苷转运蛋白，获得重组大肠杆菌，利用重组大肠杆菌实现以尿苷或胞苷为底物全细胞催化制备假尿苷。

20、进一步地，具体包括如下步骤：

21、(1)将活化好的重组大肠杆菌菌株接种至培养基中，37℃培养14-16h至菌体od600达到15-20，培养期间通过流加氨水维持ph 7.0，摇瓶培养的转速设置为200r/min，分批培养的溶氧设置为30％-40％；

22、培养基组成为：葡萄糖20-30g/l，酵母粉3-8g/l，kh2po41-3 g/l，mgso4·7h2o0.1-1g/l，feso4·7h2o1-5mg/l，vb1、vb3、vb5、vb12、vh各1-3mg/l，消泡剂2滴，其余为水，ph7.0-7.5；

23、(2)离心收集培养好的菌体，使用pbs缓冲液清洗菌体一次；将清洗后的菌体重悬在反应液中，菌体浓度od600为40左右；摇瓶催化时一次性加入5g/l底物尿苷或胞苷，分批补料催化时流加5-40g/l底物尿苷或胞苷；催化反应温度为37℃，反应时间为24h，流加氨水维持ph 7.0；

24、反应液组成为：葡萄糖15-25g/l，na2hpo4·7h2o 5-8g/l，kh2po42-4 g/l，nh4cl 2-4g/l，nacl 0.1-1g/l，mgso4·7h2o 0.1-1g/l，feso410-100 mg/l。

25、本发明取得的优点和积极效果为：

26、1、本发明使用核糖核苷水解酶将尿苷或胞苷水解为尿嘧啶、胞嘧啶和d-核糖；使用核糖激酶将d-核糖磷酸化为5-磷酸核糖；使用胞嘧啶脱氨酶将胞嘧啶转化为尿嘧啶；使用假尿苷-5-磷酸糖苷酶催化尿嘧啶与5-磷酸核糖合成假尿苷单磷酸；酶级联反应所需的atp以及假尿苷单磷酸的去磷酸化过程则通过细胞自身代谢完成。本发明设计的假尿苷酶催化反应路线与现有酶催化法(202310168205x，202111581013.9)相比均不相同(图1)，具有较强的创造性。

27、2、为了提高全细胞催化制备假尿苷的效率，本发明在底盘细胞基因组上整合核苷渗透酶基因nupc，增强了底物尿苷或胞苷向胞内的转运；敲除了底盘细胞中假尿苷转运蛋白基因psut，减少了产物假尿苷向胞内的转运。此外，优化了全细胞催化底物添加方式，采用流加补料替代一次性投料方式，减少了细胞对于底物的额外消耗。本发明设计了新颖的假尿苷酶催化合成路线，在最优的反应条件下假尿苷的最高产量达到了27.24g/l，转化率达90.8％，生产效率为1.135g·h-1·l-1，假尿苷产量和生产效率为现有酶催化法报道的最高值。

28、3、利用全细胞催化法生产核苷类产品是近年来研究的热点。本发明构建了新颖的酶催化反应路线，通过在大肠杆菌mg1655中过表达假尿苷-5-磷酸糖苷酶，过表达核糖激酶，过表达核糖核苷水解酶，过表达胞嘧啶脱氨酶，过表达核苷渗透酶，不表达假尿苷转运蛋白，获得一株生产性能高效稳定的用于假尿苷生产的重组大肠杆菌并提供其全细胞催化方法，实现了以尿苷或胞苷为底物全细胞催化制备假尿苷新工艺。