一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法

本技术涉及细胞分化和心肌组织再生医学，尤其是涉及一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法，本技术还涉及一种含有kdm5抑制剂的诱导分化培养基，及利用该诱导分化培养基诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞的方法。

背景技术：

1、胚胎干细胞(embryonic stem cell，escs，简称es细胞)具有可以分化为任何体细胞的潜能，导致人们对胚胎干细胞在再生医学、药物发现、体外疾病建模和发育生物学领域的应用寄予厚望。

2、心脏肌肉是身体中再生能力最差的组织之一。现有研究表明，成年哺乳动物的心脏不包含心脏干细胞，而且哺乳动物的心肌细胞(cardiomyocyte,cms)在出生后不久便丧失自我更新的潜力，再生能力受到限制。因此，由es细胞衍生的心肌细胞为心脏疾病的心肌细胞损伤修复和药物筛选提供了材料。然而，目前常用的小分子抑制剂诱导心肌细胞的方法效率不稳定，不利于大规模的心肌细胞生产。

3、因此，提供一种方法简单，操作简单，并且能够大幅度提高人胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞的诱导方法以解决现有技术的不足，甚为必要。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法。本技术的方法显著提高了胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一方面，本技术提供了一种kdm5抑制剂在诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞中的应用。

4、在诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞过程中，本技术发明人经过大量研究及试验发现，添加kdm5抑制剂作为额外添加的诱导因子均能够明显提高tnnt2阳性细胞的比例，说明kdm5抑制剂可以提高胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率。

5、作为本技术所述应用的优选实施方式，所述kdm5抑制剂包括cpi455。

6、利用cpi455介导的kdm5抑制，可以提高胚胎干细胞(es细胞)在定向分化为心肌细胞诱导过程中的h3k4me3整体水平，进而显著提高了胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率。

7、作为本技术所述应用的优选实施方式，所述kdm5抑制剂配制成诱导分化培养基，在诱导分化培养基中kdm5抑制剂的质量浓度为5-10μm，优选地，所述kdm5抑制剂的质量浓度为5μm。

8、在胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的过程中，采用5μm cpi455和10μm cpi455作为额外添加的诱导因子均能够明显提高tnnt2阳性细胞的比例，但是5μmcpi455的效果更佳。

9、作为本技术所述应用的优选实施方式，所述kdm5抑制剂的使用时间为诱导定向分化时间的第0天至第15天，优选地，所述kdm5抑制剂的使用时间为诱导定向分化时间的第0天至第7天。

10、第二方面，本技术提供了一种诱导分化培养基，所述诱导分化培养基包括第一分化培养基、第二分化培养基和第三分化培养基；

11、所述第一分化培养基包括基础培养基、5-10μm cpi455和6μm wnt信号通路激活剂chir99021；

12、所述第二分化培养基包括基础培养基、5-10μm cpi455和2.5μm wnt信号通路抑制剂iwp2；

13、所述第三分化培养基包括基础培养基、200μg/ml抗坏血酸和10μg/ml胰岛素。

14、本技术通过设计的诱导分化培养基可以高效获得能够自主跳动的心肌细胞。

15、优选地，所述第三分化培养基还含有5-10μm cpi455。添加cpi455可以促进tnnt2阳性细胞的产量，说明cpi455显著提高了胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率。

16、第三方面，本技术提供了上述诱导分化培养基在诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞中的应用。

17、第四方面，本技术提供了一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法，所述方法利用上述诱导分化培养基培养获得心肌细胞。

18、作为本技术所述方法的优选实施方式，所述方法包括以下步骤：

19、使用第一分化培养基将胚胎干细胞诱导分化至中胚层；使用第二分化培养基对所述中胚层进行下一步诱导分化为心肌中胚层；使用第三分化培养基对心肌中胚层进行下一步诱导分化，获得心肌细胞。

20、作为本技术所述方法的优选实施方式，所述方法包括以下具体步骤：

21、1)向生长状态良好、细胞密度达到90％以上的胚胎干细胞中加入第一分化培养基培养24小时，诱导细胞往中胚层分化；并于诱导培养的第2天至第3天，切换成含有cpi455的rpmi-1640维持培养基孵育48小时，以维持中胚层细胞的状态。

22、2)在诱导培养的第3天至第4天，将培养基更换为第二分化培养基，诱导细胞往心肌中胚层分化；并于诱导培养的第5天至第6天将培养基更换为含有cpi455的rpmi-1640维持培养基，孵育48小时以维持心肌中胚层细胞的状态。

23、3)诱导培养的第7天至第15天，使用第三分化培养基，进一步诱导分化为心肌细胞。

24、优选地，含有cpi455的rpmi-1640维持培养基中cpi455的浓度为5μm。

25、每种分化培养基使用结束之后，均要用含5μm cpi455的rpmi-1640维持培养基孵育细胞48小时，以维持细胞数量和特性，再更换下一种分化培养基。

26、作为本技术所述方法的优选实施方式，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞，优选为h1人胚胎干细胞。

27、在一些具体实施例中，所述步骤1)中，利用es细胞的生长培养基(metsr1培养基)将h1人胚胎干细胞接种至提前包被了matrigel胶的6孔板中进行培养和扩增，然后将生长至对数生长期的h1人胚胎干细胞以1:6的比例进行传代。

28、所述方法包括以下具体步骤：

29、用accutase细胞解离试剂消化处理处于对数生长期且细胞状态良好的h1人胚胎干细胞，于37℃培养箱中处理3分钟；然后用等体积的新鲜dmem-f12培养基稀释accutase，将干细胞克隆团吹散成单细胞，1000rpm离心3min；吸走上清，用含10μm的rock抑制剂y27632的mtesr1培养基重悬细胞，并将其接种于提前用matrigel胶包被的6孔板中，再置于37℃、5％ co2细胞培养箱中培养3-4天，每天更换新鲜的mtesr1培养基；

30、在所有具体实施例中，利用h1人胚胎干细胞体外定向诱导分化心肌细胞的过程均在12孔板中进行，具体步骤包括以下：将使用accutase消化获得的单细胞悬液，用含10μmrock抑制剂y27632的mtesr1培养基接种于已提前用matrigel胶包被的12孔板中，然后置于37℃、5％ co2孵箱中培养。随后每天更换新鲜mtesr1培养基，培养3天。在细胞长至90％密度左右(传代培养第三天)，定义为诱导分化的第0天，开始使用第一分化培养基对h1人胚胎干细胞进行中胚层的诱导分化。

31、本技术对采用胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞方法获得的心肌细胞进行心肌诱导效率的检测，检测时间为体外定向诱导分化的第15天。

32、优选地，使用流式细胞术和免疫荧光技术对心肌诱导效率进行检测。

33、优选地，所述检测使用心肌细胞特异性标记物tnnt2进行流式检测和免疫荧光染色。

34、通过流式细胞术检测day15的tnnt2阳性细胞比例。

35、由结果可知，额外添加5μm cpi455作为诱导因子能够明显提高h1人胚胎干细胞定向心肌细胞分化的效率。

36、另一方面，通过免疫荧光技术分别分析day15时心肌细胞特异性标志物tnnt2的表达水平。由结果可知，与对照组相比，增加5μm cpi455作为诱导因子的h1细胞经15天定向心肌诱导后，tnnt2的表达明显增强。

37、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

38、本技术提供的以cpi455为诱导因子调节诱导人胚胎干细胞往心肌细胞方向分化的方法能够为干细胞来源的心肌细胞的生产提供有效可行的新方法，且效果稳定，有利于大规模生产。本技术通过cpi455介导的kdm5抑制，提高人胚胎干细胞在定向心肌诱导过程中心肌特异性相关基因的h3k4me3整体水平，进而显著提高了胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率，并且由本技术的方法得到心肌细胞纯度较高，应用前景较广，可为研究早期心脏发育、心脏疾病的再生修复以及药物筛选提供材料，有较广泛的应用前景。