一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法与流程

本发明涉及植物单细胞提取领域，具体是指一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法。

背景技术：

1、半枝莲为唇形科黄岑属多年生草本植物，可全草入药，含有苯丙氨酸、生物碱、黄酮苷、皂苷、多糖等成分。临床上对于半枝莲的化学成分研究较为充分，但对其抗病的分子机制研究尚属空白，建立半枝莲遗传性能稳定的单细胞群落，有助于未来研究其具体抗肿瘤作用位点和机理。现有单细胞提取方式只能提取到原生质体，并不包括细胞壁，无法保证植物单细胞结构的完整性；或通过亚氯酸钠处理生物质材料进行脱木素反应，植物细胞木质素及半纤维素脱除，获得完整单细胞，但只适用于木本、禾本植物；压电技术制备植物单细胞样本，极易导致细胞的损坏和破碎，且操作方式繁琐。

技术实现思路

1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法，为解决现有单细胞提取方法，只能提取得到原生质体，不包括细胞壁，本发明提出通过选取半枝莲幼嫩叶片为实验材料，获得大量疏松的愈伤组织，便于后续完整单细胞悬浮液的制备；同时选用含有多聚半乳糖醛酸酶、吗啉乙磺酸、风车子抑素a4的单细胞液体培养基，可以选择性的在溶解细胞间物质的同时不破坏植物细胞壁结构，促进形成完整单细胞集合体；此外，采用纤维素、木质素、葡萄糖和甘油制备细胞稳定液，能够将收集好的单细胞进行完整保存，解决了所制植物单细胞极易损坏和破碎的问题。

2、为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下，本发明提出了一种半枝莲完整单细胞提取及应用方法，其中，所述半枝莲完整单细胞提取方法包括如下步骤：

3、（1）选择健壮新鲜半枝莲植株，选取上部幼嫩叶片，使用无菌去离子水冲洗干净，得到半枝莲原材料；

4、（2）在超净工作台中，将半枝莲原材料使用70%酒精浸泡15-30 s，再使用无菌去离子水冲洗2-4次，使用剪刀将半枝莲原材料剪成小块，得到半枝莲叶片组织；

5、（3）以ms培养基为基础培养基，其中6-苄氨基嘌呤的浓度为1-3 mg/l、蔗糖的浓度为20-35 g/l、琼脂粉的浓度为4-6 g/l，在玻璃烧杯中混合温度为40-60℃、混合转速为180-200 r/min、混合时间为5-8 min、调节ph为5.5-6.5，充分搅拌，得到诱导愈伤组织培养基；以1/2ms培养基为基础培养基，其中，风车子抑素a4的浓度为5-8 mg/l、吗啉乙磺酸的浓度为15-20 mg/l、多聚半乳糖醛酸酶的浓度为3-5 mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1-2mg/l、6-糖基氨基嘌呤的浓度为0.4-0.6 mg/l，在玻璃烧杯中混合温度为20-28℃、混合转速为180-200 r/min、混合时间为5-8 min、调节ph为5.5-6.0，充分搅拌，得到单细胞液体培养基；

6、（4）将半枝莲叶片组织放至诱导愈伤组织培养基中恒温27-29℃，培养时间为12-16 d，得到大量疏松的愈伤组织；

7、（5）使用灭菌的镊子挑取愈伤组织，将其转移至单细胞液体培养基中，在摇床温度为20-28℃、100-150 r/min振荡速度、培养时间为12-24 h，振荡培养得到完整单细胞悬浮液；

8、（6）以100-300目细胞过滤筛，过滤除去完整单细胞悬液中的大块细胞团，得到细胞滤液；

9、（7）将细胞滤液以500-800 r/min的转速离心8-12 min，去除上部细胞碎片，采用40-60目细胞过滤筛过滤，得到半枝莲完整单细胞；

10、（8）以50%甘油为溶剂，其中纤维素的浓度为5-8 g/l、木质素的浓度为2-4 g/l、葡萄糖的浓度为3-6 g/l，充分混匀，得到单细胞稳定剂；

11、（9）将回收的半枝莲完整单细胞分装于2ml无菌冻存管中，加入单细胞稳定剂，体积比为1:1，于-80℃冷冻保存。

12、优选地，步骤（1）中，所述健壮新鲜半枝莲植株选用无菌半枝莲组培幼苗。

13、优选地，步骤（2）中，所述半枝莲原材料使用70%酒精浸泡浸泡25 s，再使用去离子水冲洗3次。

14、优选地，步骤（3）中，所述诱导愈伤组织培养基，其中6-苄氨基嘌呤的浓度为2 mg/l、蔗糖的浓度为25 g/l、琼脂粉的浓度为5 g/l，在玻璃烧杯中混合温度为55℃、混合转速为190 r/min、混合时间为7 min、调节ph为6.0；所述单细胞液体培养基中，风车子抑素a4的浓度为6 mg/l、吗啉乙磺酸的浓度为18 mg/l、多聚半乳糖醛酸酶的浓度为4 mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1.5 mg/l、6-糖基氨基嘌呤的浓度为0.5 mg/l，在玻璃烧杯中混合温度为22℃、混合转速为185 r/min、混合时间为6 min、调节ph为5.6。

15、优选地，步骤（4）中，所述半枝莲叶片组织培养时间为14 d；步骤（5）中，所述摇床温度为26℃，振荡速度为120 r/min，培养时间为16 h；步骤（6）中，所述细胞过滤筛为200目；步骤（7）中，所述细胞滤液转速为600 r/min，离心10 min，细胞过滤筛为50目。

16、优选地，步骤（8）中，所述单细胞稳定剂，其中纤维素的浓度为6 g/l、木质素的浓度为3 g/l、葡萄糖的浓度为4 g/l。

17、本发明还提供了一种半枝莲完整单细胞的应用方法，具体包括如下步骤：

18、（1）将所提取的半枝莲完整单细胞冻存管，置于冰上解冻10-15 min，得到半枝莲完整单细胞冻存液；

19、（2）以ph为5.5的磷酸缓冲液为溶剂，其中纤维素酶r10的浓度为13-17 g/l、纤维素酶rs的浓度为10-13 g/l、离析酶的浓度为12-16 g/l，搅拌混匀，得到酶解液；

20、（3）每1ml半枝莲完整单细胞冻存液中加入50-80 ml酶解液，黑暗条件酶解1.5-3h，得到半枝莲单细胞原生质体；

21、（4）直接将所制备半枝莲单细胞原生质体通过流式细胞仪进入10xgenomoics系统制备文库，利用illumina平台测序。

22、优选地，步骤（1）中，所述半枝莲完整单细胞冻存管，置于冰上解冻12 min。

23、优选地，步骤（2）中，所述酶解液中纤维素酶r10的浓度为14 g/l、纤维素酶rs的浓度为11 g/l、离析酶的浓度为13 g/l。

24、优选地，步骤（3）中，所述半枝莲完整单细胞冻存液，每1ml中加入60 ml酶解液，黑暗条件酶解2.5 h。

25、本发明取得的有益效果如下：

26、（1）本发明直接从无菌半枝莲组培幼苗植株选取幼嫩叶片，并将其诱导培育出大量疏松的愈伤组织，便于后续完整单细胞悬浮液的制备；

27、（2）单细胞液体培养基中含有多聚半乳糖醛酸酶，可以选择性地溶解细胞间物质，同时保护了半枝莲细胞的细胞壁结构，吗啉乙磺酸的加入使得酶促反应更加稳定，风车子抑素a4作为植物微管抑制剂，能够形成均一的完整单细胞集合体，可提高半枝莲完整单细胞的产率；

28、（3）采用木质素、纤维素、葡萄糖和甘油作为细胞稳定液，能够将收集好的完整单细胞进行保存，解决了所制备植物单细胞极易损坏和破碎的问题，随用随取，半枝莲完整单细胞酶解细胞壁后，无需再次离心处理即可进行后续植物完整单细胞rna测序，简化实验流程。