一种用于种属和人类性别鉴定的组合物及含其试剂盒与应用

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于种属和人类性别鉴定的组合物及含其试剂盒与应用。

背景技术：

1、cytb基因是编码线粒体内膜上细胞色素b氧化酶的基因的一个亚基，由mtdna的h链所编码，其核苷酸序列总长约为1140bp，编码379个氨基酸。该基因的编码序列区域进化缓慢，相对保守，但是保守区中的可变区域进化快，不同种属间差异大，故可根据其序列差异来进行种属的区分。多数相关研究已经证明了cytb基因在种属鉴定中的有效性。y染色体特异性遗传标记在人类性别鉴定以及生物样本的起源方面有着非常重要的作用，这些标记还可以在性侵犯案件中提供重要信息，以确定受害者物品中是否存在男性dna。amelogenin基因是编码牙釉质蛋白的一段基因序列，amelx和amely为amelogenin基因座上的一对等位基因，分别位于xp22.1-22.3和yp11.2，二者之间具有88.9％的同源性。目前，已有部分研究者针对amelogenin基因的不同片段开发了不同引物组，将其用于性别鉴定，并应用于许多商业法医dna分型试剂盒中。

2、目前，法医学鉴定人员较为常用的种属鉴定方法有环状免疫沉淀法、抗人血红蛋白胶体金试验及各种dna分析技术；而性别鉴定更依赖于dna分析。常见的dna分析技术主要包括聚合酶链式反应(pcr)、多重pcr、实时荧光定量pcr技术、数字pcr技术、snp技术、测序技术等。但这些方法普遍存在一定不足，例如，耗时长、操作繁琐，并且依赖于精密复杂的仪器等，使检案过程过于繁琐耗时，不利于及时有效地打击犯罪。

3、lamp技术是一种恒温扩增手段，相对于pcr技术，可在短时间内产生大量扩增子，对靶基因的识别具有更高的特异性与灵敏度。另外，多重lamp体系的应用也已出现，例如利用酶切法和焦磷酸测序法，但该方法基于终点检测，无法实现多各靶标分子的定量及实时检测。同时由于lamp体系所用dna聚合酶缺失5’-3’核酸外切酶活性，无法水解探针而释放荧光，使建立多重lamp扩增体系出现了一定技术瓶颈。现有研究报道所建立的基于荧光探针的多重lamp体系，主要是通过链置换激活，特异性仍然不足，并且该技术并不能对序列高度相似的snp进行区分，例如，中国专利申请201180040896.0公开了一种能够快速区分所选择病原体的所选择株与相同种内其它种群的基于基因的诊断法，可以通过使用寡核苷酸探针，称为“同化探针”，来完成dna的lamp的序列特异性实时监测，所述同化探针包含两条寡核苷酸链，其中一条包含猝灭剂(称为淬灭探针)而另一条包含荧光团(称为荧光探针)，在lamp反应期间，当所述两条链互相替换时，产生荧光信号；中国专利申请202110824236.7公开了一种基于lamp技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法，所述引物探针组合包括n基因引物探针组合和/或e基因引物探针组合，所述探针包含两条寡核苷酸链，其中第一寡核苷酸链包含位于3’端的淬灭剂，第二寡核苷酸链包含位于5’端的荧光基团并在其5’部分与第一寡核苷酸链互补，在环介导等温扩增反应期间，当所述两条寡核苷酸链互相替换时，产生荧光信号。

4、因此需要建立一种可用于法医学种属及性别鉴定、特异性更高的，可以对序列高度相似的snp进行区分的引物探针组。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种包含基于dna糖基酶激活的探针的组合物及含其试剂盒。该探针中引入含修饰碱基的脱氧核糖核苷酸，能被dna糖基酶进行特异性识别并激活荧光，相比于现有的仅基于链置换反应的荧光探针，进一步提高了反应的特异性。在此基础上，由于荧光产生不受引物二聚体形成的影响，可通过增加引物浓度来提高灵敏度。

2、本发明选用的种属特异性基因cytb位于呈环状、具有高拷贝数的线粒体dna上，比核dna更抗降解，可用于检测的目的dna丰度会更高，从而更适用于降解和痕量检材；不经过dna的分离提取过程，省去核酸纯化；采用基于udg酶的防污染系统，有效地避免了气溶胶对检测结果的干扰。通过本发明引物和探针的设计，可以实现单体系多重lamp对多种靶标的检测，建立了一种特异灵敏，快速有效的法医学生物检材种属及性别鉴定的快速检测方法。

3、为了实现上述的技术目的，本发明提出的技术方案如下所示：

4、在第一方面，本发明提供了一种用于种属和人类性别鉴定的组合物，所述组合物包括第一核酸组合物、第二核酸组合物、第三核酸组合物和荧光探针组；所述第一核酸组合物和荧光探针组，与第二核酸组合物、第三核酸组合物中其的一种联合使用；

5、其中，第一核酸组合物包括：

6、cytb-f3、cytb-b3、cytb-fip、cytb-bip、cytb-lf和cytb-lb；

7、第二核酸组合物包括：

8、amely-f3-1、amely-b3-1、amely-fip-1、amely-bip-1、amely-lf-1和amely-lb-1；

9、第三核酸组合物包括：

10、amely-f3-2、amely-b3-2、amely-fip-2、amely-bip-2、amely-lf-2和amely-lb-2；

11、所述cytb-f3的核苷酸序列如seq id no:1所示；

12、所述cytb-b3的核苷酸序列如seq id no:2所示；

13、所述cytb-fip的核苷酸序列如seq id no:3所示；

14、所述cytb-bip的核苷酸序列如seq id no:4所示；

15、所述cytb-lf-1的核苷酸序列如seq id no:5所示；

16、所述cytb-lb-1的核苷酸序列如seq id no:6所示；

17、所述amely-f3-1的核苷酸序列如seq id no:8所示；

18、所述amely-b3-1的核苷酸序列如seq id no:9所示；

19、所述amely-fip-1的核苷酸序列如seq id no:10所示；

20、所述amely-bip-1的核苷酸序列如seq id no:11所示；

21、所述amely-lf-1的核苷酸序列如seq id no:12所示；

22、所述amely-lb-1的核苷酸序列如seq id no:13所示；

23、所述amely-f3-2的核苷酸序列如seq id no:15所示；

24、所述amely-b3-2的核苷酸序列如seq id no:16所示；

25、所述amely-fip-2的核苷酸序列如seq id no:17所示；

26、所述amely-bip-2的核苷酸序列如seq id no:18所示；

27、所述amely-lf-2的核苷酸序列如seq id no:19所示；

28、所述amely-lb-2的核苷酸序列如seq id no:20所示。

29、在一个实施方案中，所述第一核酸组合物、荧光探针组与第二核酸组合物联用。

30、在一个实施方案中，所述第一核酸组合物、荧光探针组与第三核酸组合物联用。

31、在一个实施方案中，所述第一核酸组合物、第二核酸组合物和第三核酸组合物包括内引物、外引物和环引物。其中外引物tm值在55-65℃间，内引物tm值在58-70℃间，环引物tm值在55-65℃间，各引物gc含量在40％-70％之间。

32、各引物所识别的序列片段间有一定合适的间距，如f2末端至b2末端间距120-160个碱基，f2的5’端至f1的5’端(形成环结构的区域)间距40-60个碱基，f2与f3间隔0-60个碱基。

33、在一个实施方案中，所述荧光探针组至少包括三条荧光探针：

34、至少一条针对人cytb基因的第一荧光探针，至少两条针对人amely基因的第二荧光探针和第三荧光探针；

35、其中第一荧光探针与第一核酸组合物联合使用，第二荧光探针与第二核酸组合物联合使用，第三荧光探针与第三核酸组合物联合使用。

36、在一个实施方案中，所述荧光探针的长度范围为18-60个碱基。

37、在一个实施方案中，所述荧光探针和lamp扩增子的loop区域结合。

38、在一个实施方案中，所述荧光探针中包含：一个碱基被替换为修饰碱基的脱氧核糖核苷酸。

39、在一个实施方案中，所述荧光报告基团与淬灭基团位于含有修饰碱基的脱氧核糖核苷酸的两侧的碱基上。

40、在一个实施方案中，所述荧光报告基团与淬灭基团间隔1-5个碱基。

41、在一个优选的实施方案中，所述荧光报告基团与淬灭基团可以间隔1个、2个、3个、4个和5个碱基。

42、在一个实施方案中，所述荧光报告基团选自fam，sima，hex，rox，tamra，texas red和calfluor610中的至少一种；和/或

43、淬灭基团选自bhq1，bhq2，bhq3，mgb，dabcyl和eclipse中的至少一种。

44、在一个实施方案中，所述修饰碱基选自7,8-二羟基-8-氧代鸟嘌呤，8-羟基腺嘌呤，fapy-鸟嘌呤，甲基-fapy-鸟嘌呤，fapy-腺嘌呤，黄曲霉毒素b1-fapy-鸟嘌呤，5-羟基-胞嘧啶和5-羟基尿嘧啶中的至少一种。

45、在一个优选的实施方案中，所述修饰碱基可以为7,8-二羟基-8-氧代鸟嘌呤。

46、在一个实施方案中，所述荧光探针的3’端修饰有阻断基团，所述阻断基团选自c3spacer(三个碳原子的碳链)，c6 spacer(六个碳原子的碳链)，磷酸基团，氨基基团，生物素-teg，聚六乙二醇，反转dt、反转dg或双脱氧核苷酸中的至少一种。

47、在一个实施方案中，所述荧光探针的gc含量在30％-70％之间；

48、和/或，所述荧光探针的tm值在58℃-68℃之间。

49、在一个实施方案中，所述第一荧光探针的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述第二荧光探针的核苷酸序列如seq id no:14所示，所述第三荧光探针的核苷酸序列如seq idno:21所示。

50、在一个实施方案中，所述修饰碱基可被dna糖基酶识别并切割，以使荧光报告基团与淬灭基团分离并激活荧光。

51、在第二方面，本发明提供一种用于种属和人类性别鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的组合物。

52、在一个实施方案中，所述试剂盒包括样本处理液，mg2+，dntps，dna聚合酶，dna糖基酶，udg酶和反转录酶中的至少一种。

53、在一个实施方案中，所述dntps可以包括为0.1mm-10mm datp、0.1mm-10mm dttp、0.1mm-10mm dctp、0.1mm-10mm dgtp和0.1mm-10mm dutp。

54、在一个实施方案中，所述样本处理液可以为1mm-50m的无机盐溶液和/或5％-95％的有机溶液。

55、在一个优选的实施方案中，所述无机盐溶液可以选自nacl溶液、kcl溶液、licl溶液、naoh溶液、koh溶液和caoh溶液中的至少一种。

56、在一个优选的实施方案中，所述有机溶液可以选自sds溶液、edta溶液、triton x-100溶液、tween-20溶液、tween-80溶液、peg-200溶液、bsa溶液、明胶溶液、甲酰胺溶液、四甲基氯化铵溶液和甜菜碱溶液中的至少一种。

57、在一个优选的实施方案中，所述dna聚合酶可以为1u-50u的bst dna polymerase。

58、在一个优选的实施方案中，所述dna糖基酶可以为0.1u-80u的8-氧代鸟嘌呤dna糖基酶，其具有两种酶活：dna n-糖基酶活性和ap裂解酶活性。

59、在一个优选的实施方案中，所述反转录酶可以为0.1u-50u的禽骨髓母细胞瘤病毒(amv)反转录酶，莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mulv)反转录酶或rtx反转录酶。

60、在一个优选的实施方案中，所述的udg酶可以为0.1u-50u尿嘧啶-dna糖基化酶。

61、在第三方面，本发明提供了一种所述组合物或所述试剂盒在鉴定种属和人类性别中的应用。

62、在第四方面，本发明提供了一种鉴定种属和人类性别的方法，所述方法包括以下步骤：

63、(1)向待测样本中加入样本处理液后静置，以提取或释放核酸；

64、(2)利用所述组合物或试剂盒扩增步骤(1)所得核酸；

65、(3)结果判读。

66、在一个实施方案中，所述待测样本可以为dna样本，体液样本，分泌物样本，排泄物样本，组织样本或脱落细胞样本。

67、在一个实施方案中，所述组织样本包括软组织样本例如肌肉、脏器等，硬组织样本例如牙齿、骨骼等，角化组织样本例如毛发、指甲等。

68、在一个优选的实施方案中，所述体液包括全血、血痕、唾液、尿液、汗液等。

69、在一个实施方案中，步骤(2)种所述扩增的条件为恒温(60℃-68℃)扩增，或恒温(60℃-68℃)扩增15-45min(一步法)或30℃-50℃孵育5min-30min后，再以60℃-68℃恒温扩增15-45min(两步法)。

70、在一个优选的实施方案中，所述扩增的反应体系为0.2mm-200mm tris-hcl，3mm-300mm kcl，1mmol-75mmol nacl，0.1mm-50mm的mgso4，0.05％-10％ tween-20，0.2mm-150mm(nh4)2so4，0.1mm-10mm dntp mix，1u-50u bst dna polymerase，0.1u-80u dna糖基酶和0.1u-50u udg酶。

71、在一个优选的实施方案中，所述扩增的反应体系为0.2mm-200mm tris-hcl，3mm-300mm kcl，1mmol-75mmol nacl，0.1mm-50mm的mgso4，0.05％-10％ tween-20，0.2mm-150mm(nh4)2so4，0.1mm-10mm dntp mix，1u-50u bst dna polymerase，0.1u-80u dna糖基酶，0.1u-50u udg酶和0.1u-50u反转录酶。

72、在一个实施方案中，步骤(3)中所述结果判读包括：若有人种属特异性探针荧光激发，而无人类男性特异性探针荧光激发，则表明待测样本含有人类女性成分；若两种探针荧光均被激发，则表明待测样本含有人类男性成分；若无任何一种探针荧光激发，则表明待测样本不含有人源性成分。

73、与现有技术相比，本发明提供的组合物或试剂盒至少具有以下有益效果：

74、(1)灵敏度高，可检测低至10拷贝的靶标dna；

75、(2)检测效率高，核酸扩增的模板为dna时，对样本采取直接扩增技术，可显著节约时间；

76、(3)特异性高，通过荧光探针实时监测每种探针对应的扩增动力学曲线，或直接检测反应的终末荧光信号；

77、(4)防止气溶胶污染。