一种生物体共生菌的多重PCR检测方法

本发明涉及生物，特别是涉及一种生物体共生菌的多重pcr检测方法。

背景技术：

1、不同种类的共生菌在自然界广泛存在，不可避免地要出现不同种的共生细菌存在于同一个体的情况。共生菌主要有wolbachia、spiroplasma、cardinium、arsenophonus、rickettsia和flavo-bacterium clade等等。两种或多种共生菌感染同一宿主的现象称之为多重感染。了解不同共生菌在同种宿主里面的相互影响，对研究共生菌和宿主昆虫之间的关系有重要的意义。

2、在很长时间以来，已经发现了超过一种共生菌同时存在于一个宿主体内共同生活的现象，这些共生菌有时候是在分开的细胞和器官中存在，但有时也会同时存在于一个细胞之中。此外，同种共生菌的不同株系感染同一个宿主的情况(即为超感染现象)也有发现。近年来，有许多研究报道共生菌的多重感染可以对宿主产生很多复杂的影响，比如说提供给宿主有限的营养物质。然而，迄今为止，对于多种共生菌在宿主中的竞争或者合作关系和机制以及共生菌多重感染对宿主表型的影响，我们仍然知之甚少。

3、wolbachia，cardinium，spiroplasma，rickettsia是内共生菌的代表属，感染许多节肢动物物种。在分类学上，wolbachia pipients隶属于细菌门(bacteriophyta)，a变形菌纲(alpha-proteobacteria)，立克次氏体目(rickettsiales)，无形体科(aanplasmataceae)，rickettsia属的一个种。wolbachia通过对宿主进行多种生殖调控来增加自身在宿主种群中的传播。这些生殖调控主要包括胞质不亲和(cytoplasmiincompatibility，ci)，杀雄(male-killing)，诱导孤雌生殖(parthenogenesis inducing，pi)和雌性化(feminization)。

4、cardinium属于拟杆菌属，其在宿主中诱导生殖改变，例如ci、单性生殖和雌性化。cardinium属于bacteroidetes拟杆菌，sphingobacteria鞘脂杆菌纲，sphingobacteriales鞘脂杆菌目，flexibacteraceae屈挠杆菌科，且在系统发育图中单独形成一个支系，和flavobacteria纲的共生菌分支距离较远，与其亲缘关系最近的就是一种硬螂(ixodesscapularis)中的共生菌。近年来已发现，cardinium能够引起雌性化，诱导孤雌生殖，诱导胞质不亲和，影响宿主适合度和改变寄主的产卵行为。

5、spiroplasma是一类广泛存在于节肢动物体内的母系遗传的革兰氏阳性共生菌，主要参与保护其宿主免受生物和非生物胁迫。在分类学上，spiroplasma属于细菌域(baclena)、厚壁菌门(firmicutes)、柔膜菌纲(mollicutes)、虫原体目(entomoplasmatales)、螺原体科(spiroplasmataceae)、螺原体属(spiroplasma)。spiroplasma最为显著的对宿主生殖的调控方式为杀雄。其杀雄作用已经在黑腹果蝇drosophila melanogaster、异色瓢虫harmonia axyridis以及金斑蝶danaus chrysippus等昆虫中报导。除调控宿主的生殖方式，spiroplasma还能为宿主提供保护作用，帮助宿主抵御天敌的攻击。

6、rickettsia属于变形细菌纲proteobacteria的a亚群立克次氏体科ricketisiaceae的兼性真核细胞内共生菌，是昆虫次生共生菌的重要代表类群之一。早期关于rickettsia研究主要集中在脊椎动物的ricettsia群组，而关于节肢动物rickettsia的研究，尤其是生物学特性方面的研究则相对较少。随着近年来对昆虫rickettsia研究的进一步深入，发现其可通过诱导寄主昆虫雌性化、胞质不亲和杀雄等方式调控寄主昆虫的生殖行为，从而对不同寄主昆虫产生有利或有害的作用；ricketisia还可增强寄主昆虫的药剂敏感性以及保护植物病毒在植物体内的传播。

7、对节肢动物内共生菌感染情况估计，wolbachia高达24％，cardinium高达13％，spiroplasma高达5-10％，rickettsia高达52％。由于其细胞内的生活方式(一些spiroplasma物种除外)，这些细菌中的大多数不能在节肢动物宿主之外生长，并且对这四种内共生菌的检测依赖于分子方法。

8、随着研究的深入，越来越多的研究者在不同昆虫物种中同时检测到两种共生菌的存在，wolbachia和cardinium双重感染，或者是spiroplasma和rickettsia双重感染。对于未知感染状况的昆虫，为了研究wolbachia，cardinium，spiroplasma，rickettsia对寄主生殖和发育的共同调控作用，以及这四种共生菌之间的相互作用，检测昆虫体内共生菌wolbachia，cardinium，spiroplasma，rickettsia感染情况是开展研究的前提。目前对于这四种共生菌的检测主要基于pcr的分子方法分别进行检测，即通过四次pcr来完成对共生菌wolbachia，cardinium，spiroplasma，rickettsia检测。当面临大量的样本需要检测时，分别检测wolbachia，cardinium，spiroplasma，rickettsia，耗时、耗材、又耗力。多重pcr(multiplex pcr)方法则克服了常规pcr只能检测一个模板的缺点。多重pcr是在普通pcr的基础上加以改进，于一个pcr反应体系中加入多对特异性引物，针对多个dna模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的pcr技术。用多重pcr同时扩增多个目的片段，具有节省时间、降低成本、提高效率、节省珍贵的实验样本等优势。因此有必要开发一种利用多重pcr技术同时检测生物体共生菌wolbachia、cardinium、rickettsia和spiroplasma的感染情况的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种生物体共生菌的多重pcr检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，该检测方法可以实现对生物体共生菌wolbachia、cardinium、spiroplasma和rickettsia的同时检测，该检测方法特异性强，灵敏度高，并且具有节省时间、降低成本、提高效率以及节省珍贵的实验样本等优势。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种利用多重pcr检测生物体共生菌的引物组合，包括分别检测共生菌wolbachia、cardinium、spiroplasma和rickettsia的特异性引物对：

4、检测共生菌wolbachia的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.1-2所示；

5、检测共生菌cardinium的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.3-4所示；

6、检测共生菌spiroplasma的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.5-6所示；

7、检测共生菌rickettsia的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.7-8所示。

8、本发明还提供上述的引物组合在制备利用多重pcr检测生物体共生菌的试剂盒中的应用，所述共生菌包括wolbachia、cardinium、spiroplasma和rickettsia中的至少一种。

9、本发明还提供一种利用多重pcr检测生物体共生菌的试剂盒，包括上述的引物组合；所述共生菌包括wolbachia、cardinium、spiroplasma和rickettsia中的至少一种。

10、进一步地，所述试剂盒还包括2×pcr mix和ddh2o。

11、本发明还提供上述的引物组合或试剂盒在利用多重pcr检测生物体共生菌中的应用，所述共生菌包括wolbachia、cardinium、spiroplasma和rickettsia中的至少一种。

12、本发明还提供一种生物体共生菌的多重pcr检测方法，所述共生菌包括wolbachia、cardinium、spiroplasma和rickettsia中的至少一种；

13、所述多重pcr检测方法包括以下步骤：

14、提取得到待检生物体样本的总dna；

15、以所述总dna为模板，利用上述的引物组合，进行多重pcr扩增，得到扩增产物；

16、对所述扩增产物进行电泳检测，当所述扩增产物含有250bp的片段表示所述生物体样本含有共生菌wolbachia；当所述扩增产物含有300bp的片段表示所述生物体样本含有共生菌cardinium；当所述扩增产物含有485bp目的片段表示所述生物体样本含有共生菌spiroplasma；当所述扩增产物含有505bp的片段表示所述生物体样本含有共生菌rickettsia。

17、进一步地，所述多重pcr扩增的反应体系包括：2×pcr mix 6.5μl、8条引物各0.5μl、dna模板2.0μl和ddh2o 6.5μl。

18、进一步地，所述多重pcr扩增的扩增条件包括：预变性94℃，2min；94℃，30s，退火55℃，45s，延伸72℃，45s，35个循环；延伸72℃，5min。

19、本发明公开了以下技术效果：

20、本发明通过分别设计wolbachia、cardinium、spiroplasma和rickettsia的特异性引物对，使这四对特异性引物对在一个pcr反应中能正常作用，分别扩增四段不同大小的目的片段，将原本需要四次常规的pcr扩增才能完成的对四种共生菌的检测，缩减到一次多重pcr检测同时完成。

21、本发明的多重pcr检测方法，特异性强，灵敏度高，并且具有节省时间、降低成本、提高效率以及节省珍贵的实验样本等优势。