一种水溶性碳酰肼类衍生物及其制备方法、检测离子或氨基酸的方法

本发明涉及一种有机小分子探针，进一步地说，是涉及一种水溶性碳酰肼类衍生物及其制备方法、检测离子或氨基酸的方法。

背景技术：

1、众所周知，在生命系统中存在着各种活性物质影响着新城代谢和生老病死，例如，氨基酸、酶、次氯酸、硫化氢、各种阴阳离子等，对这些活性物质的检测成为了研究者们的研究热点。氨基酸作为人体必可缺少的营养物质，在物质代谢调控、信息传递方面扮演着重要角色。各种阴阳离子在机体的正常运作过程也具有十分重要的作用，如ca2+、cu2+、zn2+等阳离子参与骨骼发育、神经突出传递、金属酶构建和造血等生物过程；aco-、hso4-等阴离子在人体酸碱平衡调节、脂质合成、药物代谢和蛋白质结构稳定等方面发挥关键作用。然而，另一类离子，例如hg2+、cd2+等有很大生物毒性，只需很低的浓度就会对机体造成巨大的伤害并且可以通过食物链在人体累积。因此，上述活性物质的检测、量化以及有毒离子及时、灵敏的环境监测，在食品安全、环境保护、医疗诊断等研究领域都具有重要意义。

2、近年来，将有机小分子作为探针来检测离子和小分子的分子探针检测方法，因其具有灵敏度高、选择性好、操作简便、成本低、可实时在线监测和能在生物体中使用等诸多优点而广受关注。

3、已报道的分子探针大多是“一对一”探针，即，一种分子探针只能对一种离子或分子产生选择性识别。另外，已报道的分子探针的水溶性不佳，无法在完全的水溶液中使用，不能满足人们对复杂真实样品的检测需求。因此，面对复杂的现实环境样品，开发能在水溶液中使用的高效“一对多”多底物检测探针，具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种水溶性碳酰肼类衍生物及其制备方法、检测离子或氨基酸方法。本发明在碳酰肼的肼基上引入不同的吡啶基，获得了一类吡啶基取代的碳酰肼衍生物。相对于现有的碳酰肼类化合物，本发明提供的吡啶基取代的碳酰肼衍生物的识别功能得到了扩展与调控，能够用于cu2+、hg2+、ca2+、cd2+、zn2+、aco-、hso4-以及谷氨酸(glu)/l-天冬氨酸(asp)、赖氨酸(lys)/精氨酸(arg)识别检测。

2、本发明的目的之一在于提供一种水溶性碳酰肼类衍生物。

3、所述水溶性碳酰肼类衍生物为l1或l2；

4、所述l1的结构式为命名为n’,2-二(3-吡啶基)碳酰肼，

5、所述l2的结构式为命名为n,1-二(2-吡啶酰基)碳酰肼。

6、本发明以羰基肼为母体，在肼基的nh2或nh上引入吡啶基或吡啶酰基，构建多识别位点的分子探针。分子中的羰基和吡啶基可以结合金属离子，nh或nh2基团能与阴离子和氨基酸形成氢键；分子中既有位置相对固定的酰基(脲基)和吡啶基，又有可旋转的n–n、c-n和c-c键，其构象可随不同识别底物的结合而发生变化，形成识别选择性。芳香杂环吡啶扩大了分子的平面结构，增强了分子的光学性能，提高了探针的光信号响应能力。

7、引入到羰基肼肼基上的含氮的吡啶基可与金属离子配位且结构易于修饰。将不同的吡啶基引入碳酰肼，可以调节nh的酸度，影响其对酸性氨基酸识别能力；所引入的吡啶n原子也可提供额外的金属离子识别位点和不同的离子配位方式，提高对cu2+、hg2+、cd2+、ni2+等金属离子的选择性，为实现多底物检测提供结构基础。同时，所引入的吡啶基的平面共轭结构可以改善碳酰肼的光学性能，提高光信号检测的灵敏度。另外，将吡啶基引入碳酰肼后获得的碳酰肼衍生物具有良好的水溶性，也大大增加了其实用性。因此，本发明提供的吡啶基取代的碳酰肼衍生物是一类具有良好水溶性的“一对多”分子探针，在阴、阳离子和氨基酸检测方面有很好的应用前景。

8、本发明的目的之二是提供一种上述水溶性碳酰肼类衍生物的制备方法。

9、所述水溶性碳酰肼类衍生物的合成路线如下所示：

10、

11、其中，中的r为当中的r为时，生成物为式a所示的化合物，即l1。当中的r为时，生成物为式b所示的化合物，即l2。

12、所述水溶性碳酰肼类衍生物l1的制备方法包括：以3-肼吡啶类化合物和三光气为反应物，以碱为引发剂，在溶剂a中、保护性气体保护下，进行反应；所述3-肼吡啶类化合物为3-肼基吡啶和3-肼基吡啶盐酸盐中的一种或两种以上。

13、在水溶性碳酰肼类衍生物l1的制备方法中：

14、所述3-肼吡啶类化合物、碱与三光气的摩尔比为1-6:0.4-4:1，优选为1-3:1-4:1。在本发明的一些实施例中，3-肼基吡啶盐酸盐、碱与三光气的摩尔比为3.1:3.9:1。

15、所述碱为无机碱，例如，naoh、nahco3和koh中的一种或两种以上。为了提高l1的收率，在本发明的一些实施例中，所用碱为naoh。

16、所述溶剂a为水和有机溶剂的混合体系，所述有机溶剂优选为氯仿、二氯甲烷、四氯化碳和苯中的一种或两种以上；例如，水和氯仿、二氯甲烷、四氯化碳或苯的混合体系。其中，混合体系中水和有机溶剂的体积比可以为1-5:5-50。为了提高l1的收率，在本发明的一些实施例中，所用溶剂a为水和氯仿按照1:1组成的混合体系。

17、所述保护性气体为惰性气体或氮气。在本发明的一些实施例中，所用保护气体为氩气。

18、所述反应温度为0-78℃，优选为18～70℃。在本发明的一些实施例中，反应温度为25℃。

19、所述l1的制备方法具体可以包括以下步骤：将3-肼吡啶类化合物和碱溶于溶剂a中，得到3-肼吡啶类化合物的碱溶液，将三光气溶于溶剂a得到三光气溶液；将3-肼吡啶类化合物的碱溶液与三光气溶液混合、反应得到粗产物；粗产物浓缩后分离提纯得到所述l1。优选的，所述的浓缩是指减压蒸馏，所述提纯是利用柱层析/薄层层析和重结晶。具体可以是，反应完成后，减压除去反应液溶剂a，利用制备薄层色谱法进行分离，展开剂为二氯甲烷/甲醇(2/1，v/v)，收集紫外灯(245nm)下第二带，得到红色片状晶体即为l1。

20、所述l2的制备方法包括：以2-吡啶甲酰肼和三光气为反应物，以碱为引发剂，在溶剂b中、保护性气体保护下，进行反应。

21、在水溶性碳酰肼类衍生物l2的制备方法中：

22、所述2-吡啶甲酰肼、碱与三光气的摩尔比为1-6:0.4-4:1，优选为1-3:1-4:1。在本发明的一些实施例中，2-吡啶甲酰肼、碱与三光气的摩尔比为1.2:1:1。

23、所述碱为有机碱，例如，三乙胺和dbu中的一种或两种。为了提高l2的收率，在本发明的一些实施例中，所用碱为三乙胺。

24、所述溶剂b为有机溶剂，优选为氯仿、二氯甲烷、四氯化碳和苯中的一种或两种以上；例如，氯仿、二氯甲烷、四氯化碳或苯。为了提高l2的收率，在本发明的一些实施例中，所用溶剂b为氯仿。

25、所述保护性气体为惰性气体或氮气。在本发明的一些实施例中，所用保护气体为氩气。

26、所述反应温度为0-78℃，优选为18～70℃。在本发明的一些实施例中，反应温度为25℃。

27、所述l2的制备方法具体可以包括以下步骤：将2-吡啶甲酰肼和碱溶于溶剂b，得到2-吡啶甲酰肼的碱溶液；三光气溶于溶剂b，得到三光气溶液；将2-吡啶甲酰肼的碱溶液与三光气溶液混合、反应得到粗产物；粗产物浓缩后分离提纯得到所述l2；优选的，所述的浓缩是指减压蒸馏，所述提纯是利用柱层析/薄层层析和重结晶。具体可以是，反应完成后，减压除去反应液溶剂b，利用制备薄层色谱法进行分离，展开剂为乙酸乙酯/甲醇(80/1，v/v)，收集紫外灯(245nm)下第一带，得到淡黄色针状固体即为l2。

28、本发明的目的之三是提供上述水溶性碳酰肼类衍生物l1和l2作为检测探针检测金属离子或氨基酸酸的方法。

29、所述检测金属离子或氨基酸酸的方法包括：

30、以所述水溶性碳酰肼类衍生物l1作为检测探针，通过肉眼比色或紫外手段选择性的检测的cu2+或hg2+；或者是，以所述水溶性碳酰肼类衍生物l2为检测探针，通过肉眼比色、荧光方法识别cu2+、ca2+、zn2+、cd2+、aco-、hso4-、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或l-天冬氨酸。需要注意的是，进行检测识别时，l1或l2作为检测探针均是以溶液的形式，待测样品也是以溶液的形式；其中，待测样品的溶剂应该与相应的l1或l2的溶剂相同，或者是，待测样品的溶剂应该与相应的l1或l2的其中至少一种溶剂相同。

31、上述检测金属离子或氨基酸酸的方法具体来说包括以下任意一种以上的检测方法。

32、以所述水溶性碳酰肼类衍生物l1作为检测探针，通过肉眼比色以识别待测样品中是否含有cu2+或hg2+。通过肉眼比色以选择性识别cu2+/hg2+的方法为：(1)所述l1探针与待测样品充分接触，以形成含有经探针和cu2+/hg2+反应得到的化合物的检测体系；(2)肉眼直接观察检测体系的颜色是否由无色变为紫色，以确定所述待测样品中是否含有cu2+/hg2+。例如，当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l1的水溶液、ch3oh/h2o溶液或thf/h2o溶液的颜色变为肉眼可识别的紫色时，所述待测样品中含有cu2+。再例如，当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l1的ch3cn/h2o溶液或dmf/h2o溶液的颜色变为肉眼可识别的紫色时，所述待测样品中含有hg2+。

33、以所述水溶性碳酰肼类衍生物l1作为检测探针，通过紫外-可见吸收光谱变化以识别待测样品中是否含有cu2+或hg2+。通过紫外-可见吸收光谱变化选择性检测cu2+/hg2+的方法为：(1)所述l1探针与待测样品充分接触，以形成含有经探针和cu2+/hg2+反应得到的化合物的检测体系；(2)测量所述体系的紫外吸收光谱，以确定所述样品中cu2+/hg2+的含量。例如：

34、当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l1的水溶液、ch3oh/h2o溶液或thf/h2o溶液的紫外-可见吸收光谱，在234nm和289nm处的吸收峰强度升高并出现蓝移、同时在522nm处出现新的吸收峰时，所述待测样品中含有cu2+；对cu2+的检出限为3.55×10-6m。

35、当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l1的ch3cn/h2o溶液或dmf/h2o溶液的紫外-可见吸收光谱，在235nm和290nm处的吸收峰强度降低并分别红移到240nm和308nm处、同时在547nm处出现一个新的吸收峰时，所述待测样品中含有hg2+；对hg2+的检出限为4.74×10-6m。

36、以所述水溶性碳酰肼类衍生物l2为检测探针，通过肉眼比色以识别待测样品中是否含有cu2+。例如，当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的水溶液的颜色变为肉眼可识别的淡黄色时，所述待测样品中含有cu2+。

37、以所述水溶性碳酰肼类衍生物l2作为检测探针，通过紫外-可见吸收光谱变化以识别待测样品中是否含有cu2+。例如，当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的水溶液的紫外-可见吸收光谱，在221nm处出现新的吸收峰、在285nm处的吸收峰强度降低并蓝移至274nm处时，所述待测样品中含有cu2+；对cu2+的检出限为4.18×10-6m。

38、以所述水溶性碳酰肼类衍生物l2为检测探针，通过荧光发射光谱变化以识别待测样品中是否含有ca2+、zn2+、cd2+、aco-、hso4-、氨基酸a或氨基酸b。通过荧光发射光谱变化选择性检测ca2+、cd2+、zn2+、aco-、hso4-、谷氨酸(glu)、l-天冬氨酸(asp)、赖氨酸(lys)或精氨酸(arg)的方法为：(1)所述l2探针与待测样品充分接触，以形成含有经探针和ca2+、cd2+、zn2+、aco-、hso4-、谷氨酸(glu)、l-天冬氨酸(asp)、赖氨酸(lys)或精氨酸(arg)反应得到的化合物的检测体系；(2)测量所述体系的荧光发射光谱，以确定所述样品中ca2+、cd2+、zn2+、aco-、hso4-、谷氨酸(glu)、l-天冬氨酸(asp)、赖氨酸(lys)或精氨酸(arg)的含量。所述水溶性碳酰肼类衍生物l2探针的荧光发射光谱的激发波长为330nm。例如：

39、所述水溶性碳酰肼类衍生物l2为检测探针，其ch3oh/h2o溶液用330nm的紫外光激发会在412nm出现弱的荧光发射峰。当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的ch3oh/h2o溶液的荧光发射光谱的发射峰红移到440nm处且荧光强度增强至原来的5.4±0.5倍时，所述待测样品中含有ca2+；对ca2+的检出限为8.89×10-6m。

40、所述水溶性碳酰肼类衍生物l2为检测探针，其ch3oh/h2o溶液用330nm的紫外光激发会在412nm出现弱的荧光发射峰。当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的ch3oh/h2o溶液的荧光发射光谱的发射峰红移到459nm处且荧光强度增强至原来的7.7±0.5倍时，所述待测样品中含有zn2+；对zn2+的检出限为7.80×10-6m。

41、所述水溶性碳酰肼类衍生物l2为检测探针，其ch3oh/h2o溶液用330nm的紫外光激发会在412nm出现弱的荧光发射峰。当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的ch3oh/h2o溶液的荧光发射光谱的发射峰红移到437nm处且荧光强度增强至原来的10.9±0.5倍时，所述待测样品中含有cd2+；对cd2+的检出限为8.58×10-6m。

42、所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的乙腈溶液用330nm的紫外光激发会在423nm出现荧光发射峰。当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的乙腈溶液的荧光发射光谱的发射峰强度升高为原来的1.7±0.5倍时，所述待测样品中含有aco-；对aco-的检出限为1.11×10-6m。

43、所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的乙腈溶液用330nm的紫外光激发会在423nm出现荧光发射峰。当待测样品能使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的乙腈溶液的荧光发射光谱的发射峰降低为原来的1/10-1/8时，所述待测样品中含有hso4-；对hso4-的检出限为2.51×10-6m。

44、所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的ch3cn/h2o溶液用330nm的紫外光激发会在430nm处出现荧光发射峰。当待测样品使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的ch3cn/h2o溶液的荧光发射光谱的发射峰强度升高为原来的2±0.5倍时，所述待测样品中含有赖氨酸(lys)或/和l-精氨酸(arg)；对赖氨酸的检出限为2.75×10-6m；对l-精氨酸的检出限为5.15×10-6m。

45、所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的ch3cn/h2o溶液用330nm的紫外光激发会在430nm处出现荧光发射峰。当待测样品能使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的ch3cn/h2o溶液的荧光发射光谱发生荧光淬灭，其发射峰荧光强度降低至原来的1/9-1/7时，所述待测样品中含有谷氨酸；对谷氨酸的检出限为1.52×10-5m。当待测样品能使所述水溶性碳酰肼类衍生物l2的ch3cn/h2o溶液的荧光发射光谱发生荧光淬灭，其发射峰荧光强度降低至原来的1/27-1/25时，所述待测样品中含有l-天冬氨酸；对l-天冬氨酸的检出限为8.88×10-6m。

46、本发明通过肉眼比色和紫外手段检测cu2+时所用的溶剂可以是水、ch3oh/h2o或thf(四氢呋喃)/h2o；通过肉眼比色和紫外手段检测hg2+时所用的溶剂可以是dmf(n，n-二甲基甲酰胺)/h2o或ch3cn/h2o；通过荧光手段检测ca2+、cd2+、zn2+时所用的溶剂可以是ch3oh/h2o或水；通过荧光手段检测aco-、hso4-时所用的溶剂可以是乙腈；通过荧光手段检测glu/asp/lys/arg时所用的溶剂可以是ch3cn/h2o；l1或l2探针的浓度可以为5.0×10-5mol/l。

47、经实验验证，检测体系中的cu2+/hg2+离子时，至少不受下列离子的干扰：na+、mg2+、al3+、ca2+、cr3+、mn2+、fe3+、co2+、ni2+、zn2+、sr2+、ag+、cd2+、ba2+、pb2+、la3+、nd3+；检测体系中的ca2+、cd2+、zn2+离子时，至少不受下列离子的干扰：na+、mg2+、ca2+、mn2+、co2+、zn2+、sr2+、cd2+、ba2+、pb2+、la3+、nd3+；检测体系中的aco-离子时，至少不受下列离子的干扰：br-、cl-、hso4-、i-、no3-、h2po4-、f-、clo4-；检测体系中的hso4-离子时，至少不受下列离子的干扰：br-、cl-、i-、no3-、clo4-；检测谷氨酸/l-天冬氨酸/赖氨酸/精氨酸时，至少不受下列氨基酸的影响：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、组氨酸、l-脯氨酸、l-苯丙氨酸、d-半胱氨酸、l-甲硫氨酸、l-(+)-天冬酰胺酸、l-谷氨酰胺。

48、本发明合成的探针分子，其检测性能采用以下过程进行评价：

49、肉眼比色识别评价：配制浓度为5.0×10-5mol/l的探针分子溶液和2.5×10-3mol/l不同金属离子水溶液。取一定量的探针分子溶液与1当量金属离子水溶液混合后，肉眼直接观察溶液颜色变化。结果表明，在h2o、ch3oh/h2o和thf/h2o中，cu2+可使探针l1溶液颜色由无色变为紫色；在dmf/h2o、ch3cn/h2o中，hg2+可使探针l1溶液颜色由无色变为紫色；在h2o中，cu2+可使探针l2溶液颜色由无色变为黄色；而其余离子没有显著的变化，这说明探针分子l1、l2对在不同溶剂体系中可以对cu2+或hg2+离子有明显的比色识别选择性。

50、紫外-可见吸收光谱评价：配制浓度为5.0×10-5mol/l的探针分子溶液和2.5×10-3mol/l不同金属离子水溶液。取一定量的探针分子溶液与1当量金属离子水溶液混合后，测定探针分子及其与不同离子混合液的紫外-可见吸收光谱。结果表明，在h2o、ch3oh/h2o和thf/h2o中，cu2+可使探针l1在234nm和289nm处的吸收峰发生蓝移，并在522nm附近出现新的吸收峰；在dmf/h2o、ch3cn/h2o中，hg2+可使探针l1在235nm和290nm处的吸收峰发生红移，在547nm处出现新的吸收峰；在h2o中，当加入cu2+后，l2在221nm处出现新的吸收峰，285nm处的吸收峰强度降低并蓝移至274nm(δλ＝-11nm)，并在415nm处出现弱的吸收带，而其余离子没有此类显著的变化，这说明探针分子l1、l2对在不同溶剂体系中可以对cu2+或hg2+离子有明显的紫外识别选择性。

51、荧光发射光谱评价：配制浓度为5.0×10-5mol/l的探针分子溶液和2.5×10-3mol/l不同金属离子/阴离子/氨基酸水溶液。取一定量的探针分子溶液与1当量离子/氨基酸水溶液混合后，用330nm光激发，在330～650nm范围内测定探针分子及其与不同离子混合液的荧光发射光谱。阳离子测试(ch3oh/h2o)结果表明，探针l2在412nm出弱的荧光发射峰，当加入ca2+后，l2荧光发射峰红移到440nm(δλ＝28nm)，且荧光强度增强至原来的约5.4倍；加入zn2+后，l2荧光发射峰红移到459nm(δλ＝45nm)，荧光强度增强至原来的约7.7倍；加入cd2+后，l2荧光发射峰红移到437nm(δλ＝25nm)，荧光强度增强至原来的约10.9倍，其余测试金属离子没有引起明显变化。阴离子测试(乙腈)结果表明，加入aco-后，l2在423nm处的荧光发射峰强度升高为原来的约1.7倍；加入hso4-时，l2的荧光强度降低为原来的约1/10-1/8，其余测试阴离子没有引起明显变化。氨基酸测试(ch3cn/h2o)结果表明，赖氨酸(lys)/精氨酸(arg)可使探针l2在430nm的荧光发射峰强度升高为原来的约两倍，而谷氨酸(glu)和l-天冬氨酸(asp)则会使l2的荧光减弱为原来的约1/8和1/26，其余测试氨基酸没有引起明显变化，这说明探针分子l2在不同溶剂中对ca2+、zn2+、cd2+、aco-、hso4-、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、谷氨酸(glu)、l-天冬氨酸(asp)有明显的荧光识别选择性。

52、本发明的有益效果在于：

53、(1)本发明提供的水溶性碳酰肼类衍生物作为分子探针，其结构稳定，合成方法简单，具有响应多种底物的能力，且水溶性好，具有广阔的应用前景。

54、(2)探针l1可通过调控检测溶剂实现对cu2+或hg2+高选择性比色/紫外识别检测，检测限可达10-6m。特别是l1和l2可以在纯水中实现对cu2+单一的“肉眼”比色识别，其紫外-可见光谱检测限可达3.55×10-6m和4.18×10-6m。

55、(3)探针l2可作为多功能探针，在不同溶剂中实现对阳离子、阴离子和氨基酸的荧光识别。对ca2+、zn2+、cd2+的荧光识别可在水中进行；对aco-、hso4-可以通过不同信号模式(荧光增强和荧光淬灭)实现区分识别；在含水溶剂中，也可以实现对小分子氨基酸赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、谷氨酸(glu)、l-天冬氨酸(asp)的不同荧光响应。对阴阳离子和氨基酸的检测限均可达10-6m。

56、本发明中所述“***nm处”是指“***±5nm”。