一种针对细菌的杀菌剂活性定量检测方法

本发明属于植物保护，具体涉及一种针对细菌的杀菌剂活性定量检测方法。

背景技术：

1、细菌为广泛存在于自然界的原核生物，造成多种农作物病害，降低农产品产量和质量，如大白菜软腐病、黄瓜细菌性角斑病、核果类果树叶片穿孔病、多种农作物的青枯病等等。为了防治这些病害需要进行杀菌剂筛选，以保证所用杀菌剂有较好的防治效果，室内活性测定是筛选的第一步，但由于细菌不形成丝状菌落的特殊性，目前针对细菌的杀菌剂活性定量检测方法较少。

2、现有的一些方法已用于细菌的筛选，但可能存在着过程复杂、需要仪器设备较多的缺点，甚至有的方法原理错误。如中华人民共和国农业行业标准“ny/t 1156.16-2008杀菌剂室内生物测定试验准则杀菌剂第16部分：抑制细菌生长量试验浑浊度法”，需要分光光度计或者浊度计等检测设备，需要设备较多，一般实验室的条件不能满足。标准“gb/t38483-2020微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定抑菌圈法”，提供了一种针对细菌的代谢产物活性的检测方法，检测代谢产物对细菌的抑制作用，核心内容是把靶标细菌加入培养基中，倒皿，把代谢产物加到培养基平板中央的牛津环中，培养后测量抑菌圈大小，然后以不加代谢产物的溶剂为对照，培养一段时间后，测量抑菌圈直径和对照抑菌圈直径；该方法存在一些问题，首先，在这个方法中，除了浓度会影响抑菌圈直径，加入的代谢产物液体的量也会影响抑菌圈直径，抑制率计算结果会有不同，因此并不能说明某个浓度下抑菌圈的直径代表着抑制率，而对照组所采用的对照液，为不添加有效成分的水和溶剂等，一般没有抑菌效果，不会随着对照液的增加产生抑菌圈；其次，这个方法无法确定最高抑制率(100％抑制)，因为随着用量的增大，抑菌圈也在增大，即使出现随着代谢物浓度的增加和杀菌剂溶液量的增加抑菌圈直径不再增加，可能只是该物质对细菌的抑制达到了一个抑制极限，并不能说明此时的抑制率是100％，因为更换另一种活性成分(含杀菌剂)可能抑菌圈直径会更大；因此该方法也无法确定ec50(50％抑制率时代谢产物的浓度)；最后，该标准中抑菌率计算公式有错误，公式i＝(d1-d2)/d2×100，式中i为抑制率，d1为供试次生代谢产物平板中形成的抑菌圈直径，d2为空白对照平板中形成的抑菌圈直径，这里的d2为没有添加有效成分的对照液所产生的抑菌圈直径，一般对照液没有抑菌作用，抑菌圈直径常为0，0作为式中的分母会失去意义，所以，该方法用一种没有抑菌作用的物质来对比评价抑菌作用其本身就是错误的，因为这样计算的抑制率为无限大，而无穷大显然不符合实际。

3、抑菌圈法被许多学者采用，或把牛津环更换为滤纸片，但存在的问题是一样的，由于不能观察到杀菌剂扩散范围，只根据抑菌圈直径评价抑菌率，显然是不合理的，比如两种杀菌剂采用同一个浓度，做抑菌试验，抑菌圈大小都是2cm，但是其中一个杀菌的扩散范围为4cm，一个杀菌的扩散范围为2cm，显然扩散范围为2cm的抑菌效果更好，因为这个杀菌剂扩散到了哪里，哪里就不长细菌，而扩散了4厘米的，在它的扩散范围内长了细菌，说明抑菌效果差。这些方法存在一个共性问题，空白对照的抑菌圈直径应该在被测物质的抑菌圈直径中减去，而不是把此数值当做分母，因而此方法是错误的，所以，普遍采用的抑菌圈法不能定量评价杀菌剂的抑制率，这种方法定性是可以的。因此，一些文献常采用此方法评测杀菌剂的杀菌活性，显然其科学性存在问题。目前缺少一种不需要更多设备，简单易行的针对细菌的杀菌剂活性定量检测方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种针对细菌的杀菌剂活性定量检测方法，通过抑菌圈直径和被测杀菌剂在平板中扩散直径的对比来评价杀菌剂的活性；本发明在对照液中加入染色剂，染色剂会在平板中扩散，形成易于观察的颜色圈，颜色圈的直径理论上为杀菌剂的扩散范围；以抑菌圈和颜色圈对比评价被测杀菌剂的活性，若杀菌剂处理的抑菌圈直径d和空白对照的颜色圈直径dc相同，则认为100％抑制率；若杀菌剂处理的抑菌圈直径d为空白对照的颜色圈直径dc的一半，则认为该浓度下的抑制率为50％，其浓度即为ec50值；本发明对现有的抑菌圈法进行了改进，操作步骤简单，易于观察，方法合理，易于计算，为细菌的杀菌剂活性定量检测提供了一种新的途径。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种针对细菌的杀菌剂活性定量检测方法，该方法包括以下步骤：

3、s1、试验平板制备

4、s101、预加菌液倾注平板法：将细菌制成菌悬液，浓度为1×104～1×106cfu/ml，在150ml培养基加入1～5ml菌悬液，振荡混匀，制成含菌培养基；然后倒皿，制成含菌平板，平板厚度为3～4mm；

5、s102、涂布平板法：先制备培养基平板，然后将细菌制成菌悬液，浓度为1×104～1×106cfu/ml，取菌悬液滴加在培养基平板上，涂匀，或者用接种环蘸取菌悬液在培养基平板划密集的折线，制成带菌平板；

6、s2、不同浓度的杀菌剂药液制备：将杀菌剂用溶剂溶解，然后再用不同量的灭菌水稀释，得到不同浓度的杀菌剂药液；所述杀菌剂药液浓度包含0μg/ml；

7、s3、对照液制备：在与杀菌剂药液对应的溶剂或灭菌水中加入染色剂，得到对照液；

8、s4、杀菌剂活性测定：

9、s401、对于s101得到的含菌平板，采用打储药孔法，该方法为：用直径为4～5mm的打孔器在含菌平板中央打孔，孔深至培养皿底，除去孔中培养基，做成储药孔；取s2得到的不同浓度的杀菌剂药液分别加入到含菌平板中央的储药孔中，以加满储药孔为准，作为药剂处理组；取等量s3得到的对照液加入另一储药孔中作为空白对照组；培养皿正置，放于25～30℃培养箱培养24～48h后，分别测定0μg/ml的抑菌圈直径d0、药剂处理组抑菌圈直径d和空白对照组颜色圈直径dc，每个处理设5皿，重复3次；

10、s402、对于s102得到的带菌平板，采用滤纸片法，该方法为：在带菌平板中央放置直径为6～7mm的滤纸片，用移液器吸取s2得到的不同浓度的杀菌剂药液2～3μl分别滴加在带菌平板的滤纸片上，浸润滤纸片，作为药剂处理组；取相同量s3得到的对照液滴加在另一组带菌平板中央的滤纸片上，作为空白对照组；培养皿正置，放于25～30℃培养箱黑暗培养24～48h后，分别测量0μg/ml的抑菌圈直径d0、药剂处理组抑菌圈直径d和空白对照组颜色圈直径dc，每个处理设5皿，重复3次；

11、s5、抑制率计算：

12、公式为：r(％)＝(d-d0)/dc×100，

13、将不同杀菌剂浓度及对应抑制率均值进行软件分析，得到回归方程、相关系数r值、ec50值及ec50的95％置信区间。

14、优选地，s2所述溶剂为水或有机溶剂；

15、优选地，所述有机溶剂包括：苯、二甲苯、甲苯、二甲基甲酰胺、癸酰胺、辛酰胺、环己酮、二氯乙烷、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、辛醇、异戊醇、乙二醇醚等。

16、优选地，s2所述不同浓度的杀菌剂药液制备过程中，可以加入助剂以提高杀菌剂在水或者培养基中的渗透力；

17、优选地，所述助剂包括表面活性剂或乳化剂；

18、优选地，所述助剂包括吐温80、吐温60、吐温20，所述助剂的用量为0.1％。

19、优选地，s3所述染色剂为水溶性染色剂，包括番红o、结晶紫、酸性品红、甲基蓝；

20、优选地，所述染色剂的用量为5％～10％。

21、优选地，s4所述0μg/ml的抑菌圈直径d0、药剂处理组抑菌圈直径d和空白对照组颜色圈直径dc均不含储药孔/滤纸片直径。

22、本发明与现有技术相比具有以下的显著效果：

23、1、本发明提供了一种针对细菌的杀菌剂活性定量检测方法，在对照液中加入染色剂，染色剂会在平板中扩散，形成颜色圈，颜色圈的直径理论上也是药剂处理平板中杀菌剂的扩散范围，这样就解决了抑菌圈直径参考值的问题。通过抑菌圈直径和颜色圈直径对比来定量评价杀菌剂的抑菌率，如果药剂处理平板中抑菌圈的直径等值于空白处理平板中颜色圈的直径，即可理解为杀菌剂达到的区域内目标菌均受到了抑制，即杀菌剂处理的抑菌圈直径d和空白对照的颜色圈直径dc相同，则认为100％抑制率；如果抑菌圈直径d为颜色圈直径dc的一半，则认为该浓度下的抑制率为50％，其浓度即为ec50值。

24、2、本发明的一种针对细菌的杀菌剂活性定量检测方法中，如果增加杀菌剂溶液的量时，抑菌圈会增大，但此时增加对照液的量，颜色圈直径也对应增大。

25、3、本发明对现有的抑菌圈法进行了改进，操作步骤简单，易于观察，方法合理，易于计算，为细菌的杀菌剂活性定量检测提供了一种新的途径。

26、下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。