一种RT-qPCR检测异名百合斑驳病毒的方法

本发明涉及生物，特别是涉及一种rt-qpcr检测异名百合斑驳病毒的方法。

背景技术：

1、龙牙百合(lilium brownii var.viridulum baker)是百合科(liliaceae)百合属(lilium)多年生草本植物，是野百合(lilium brownii)的变种，因其鳞片肥大，形似龙牙而得名，具有个体肥厚而抱合紧密、颜色洁白而肉质细嫩、品质优良而营养丰富的优点，深受国内外消费者青睐(隆旺夫，1995)，为我国三大食用百合之一(赵健等，2017)。然而，在栽培过程中，龙牙百合常受到病毒病的侵染，导致其种球减产、花蕾畸形和凋落等，严重影响其产量和品质(徐榕雪，2007)。目前已经发现百合的病毒病原约有14种，其中包括异名百合斑驳病毒(lily mottle virus，lmov)。目前防治百合病毒病最有效的方法是利用病毒检测技术结合病毒脱除技术生产脱毒种球，并在生产中实时监测病毒的发生，防止其蔓延。因此，建立高效、快速、灵敏、准确的百合病毒检测技术至关重要。

2、目前常见的植物病毒病检测方法有指示植物法、电镜检测法、酶联免疫吸附法和分子生物学方法。

3、早期的植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法即指示植物检测法，即通过汁液摩擦接种或嫁接传染方式将待检测带毒植株的汁液接种到一种或几种指示植物上，观察其在指示植物上表现出的症状来进行检测的方法。但当从植物的直观性状表现上无法辨析感染病毒的类别时，就需要借助于显微镜进行更细微层次检测。一般通过对待测组织进行制样，借助负染色技术以及切片技术的应用进行观察，可以观测到病毒引起的寄主细胞的病变和内含体特征，是深度研究病毒病机理的重要手段之一(张伟等，2013)。但仪器设备比较昂贵，制片和操作技术复杂不易掌握，对操作人员技术水平要求较高(刘文洪等，2003)。随着免疫学的发展，建立了病毒检测的酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，elisa)，该方法具有快速、直观、费用较低等优点，逐渐成为病毒检测的主要方法。酶联免疫吸附法将植物病毒作为抗原，注射至动物体内产生抗体。每种病毒产生的抗血清具有特异性识别功能，可根据已知病毒的抗血清检测未知病毒。但纳克级别以下无法检测，且需制备高质量的抗血清，易出现假阴性(王继华等，2004)。此外，因抗原抗体反应具有专一性，但不同百合植株中病毒抗原会有所差异，所以常会漏检某一病毒或某一株系病毒。

4、分子生物学技术通过检测病毒遗传物质(rna、dna)确定病毒的存在，稳定性、灵敏性更高，适用于几乎所有植物病毒及类病毒的检测。早期的分子生物学病毒检测技术，主要指核酸杂交技术和双链rna电泳技术，但技术难度较高，随着聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，pcr)技术的快速发展，这两种方法逐渐被淘汰，基于pcr技术的病毒检测方法成为当前检测技术的主流。以核酸检测为代表的分子生物学检测技术主要包括pcr技术、多重pcr技术、荧光定量pcr技术及环介导等温扩增技术(lamp)。

5、pcr是体外模拟体内基因复制的技术，能够在短时间内大量扩增目的dna片段。其基本过程是：(1)双链dna经过高温(95℃)变性，解链变成两条单链dna；(2)单链d na低温(与引物有关)复性，引物与单链dna上的目的基因片段的启始位点互补结合；(3)72℃延伸，在引物的引导下和taqdna聚合酶的催化下，以目的dna为模板，合成新的d na链。逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)则是在常规pcr基础上运用逆转录酶，将逆转录与基因扩增在一个反应管内进行。而多重pcr技术的基本原理与pcr类似，区别在于同一个反应体系中加入了2对以上的特异性引物，可以同时完成多个目的基因的扩增，这样一个反应体系就可以同时检测多个病毒，从而减少检测成本和时间。由于植物经常发生多种病毒复合侵染的情况，因此多重pcr检测方法在植物病毒检测中应用频繁。

6、迄今为止，针对百合感染的lmov的检测开发出了多种检测技术，其中最常用的手段为分子生物学技术，主要包括pcr技术、多重pcr技术和lamp技术，以上方法虽然可以检测出百合感染的lmov病毒，但在检测灵敏度和定量等方面存在劣势。

7、实时荧光定量pcr(rt-qpcr)是pcr技术与荧光技术相结合的一种方法，其原理是将荧光染料或荧光标记的特异性探针加入到pcr反应体系中，根据荧光信号的积累实时监测整个pcr过程。目前lmov病毒的rt-qpcr最低检出限仅达到了1pg/ml，如何进一步提升其检测灵敏度，是本领域技术人员亟待解决的重要技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种rt-qpcr检测异名百合斑驳病毒的方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法对低浓度异名百合斑驳病毒含量的龙牙百合组织样本，具有较好的检出率。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种rt-qpcr检测异名百合斑驳病毒的引物对，包括核苷酸序列如seqid no.3所示的q-lmov-f引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的q-lmov-r引物。

4、本发明还提供上述的引物对在制备rt-qpcr检测异名百合斑驳病毒的试剂盒中的应用。

5、本发明还提供一种rt-qpcr检测异名百合斑驳病毒的试剂盒，包括上述的引物对。

6、进一步地，所述试剂盒还包括内参引物actin-f和actin-r，核苷酸序列分别如seqid no.5-6所示。

7、本发明还提供上述的引物对或试剂盒在rt-qpcr检测异名百合斑驳病毒中的应用。

8、本发明还提供一种rt-qpcr检测异名百合斑驳病毒的方法，包括以下步骤：

9、提取得到待检样品的总rna，之后反转录得到cdna；

10、以所述cdna为模板，利用上述的引物对进行rt-qpcr反应，根据ct值判断所述待检样品中是否含有异名百合斑驳病毒：当15<ct值<35时，为阳性，即为含有所述异名百合斑驳病毒；当ct值≥35时，为阴性，即为不含有所述异名百合斑驳病毒。

11、进一步地，所述rt-qpcr反应的反应体系包括：ddh2o 3.6μl、qpcr super mix 5μl、10μm上游引物0.2μl、10μm下游引物0.2μl和cdna 1μl。

12、进一步地，所述rt-qpcr反应的反应程序为：94℃30s；94℃5s，60℃5s，65℃5s，40次循环。

13、本发明公开了以下技术效果：

14、本发明针对lmov基因组编码外壳蛋白(coat protein，cp)基因保守区域，设计了特异性强的rt-qpcr检测引物，并建立了一种高效的rt-qpcr检测方法，可为lmov的准确高效监测防控提供技术支持。

15、本发明建立的rt-qpcr法检测龙牙百合感染lmov病毒的技术体系全程闭管，无需电泳观察，不仅减少了有毒试剂的接触，缩减了检测时间(约2h左右)，达到快速检测的目的，而且针对低浓度lmov病毒含量的百合叶片组织样本具有较好的检出率，针对重组质粒的检测下限达到0.1pg/ml。此外，整个检测过程采用荧光信号放大及计算机全程控制，有效减少了人为误差，并提高了灵敏度。